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去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因通过线粒体凋亡路径促进大鼠血管平滑肌细胞凋亡
目的 研究去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素2(tMfn2)基因对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响及其相关的信号通路.方法 用携带tMfn2基因和线粒体融合素2(Mfn2)基因的重组腺病毒(Adv-tMfn2和Adv-Mfn2)感染VSMC.采用流式细胞术、细胞凋亡ELISA、TUNEL染色等方法检测tMfn2对VSMC凋亡的影响.Western blot分析磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)以及线粒体凋亡路径中B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关的X蛋白(Bax)、有活性的天冬氨酸特异-半胱氨酸蛋白酶9(cleaved caspase-9)的表达变化.结果 流式细胞仪检测和ELISA结果表明.tMfn2促VSMC凋亡的作用显著强于Mfn2,且呈时间依赖性[72 h凋亡率分别为(79.2±0.12)%和(65.0±1.2)%,P<0.01].TUNEL染色发现tMfn2组的凋亡细胞明显多于Mfn2组(P<0.01).Western blot结果显示,tMfn2和Mfn2组中p-Akt水平均明显降低,但前者作用更显著(P<0.01).进一步检测线粒体凋亡路径中的相关蛋白,tMfn2组的Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低,且cleaved caspase-9的活性明显增强,较Mfn2诱导凋亡的作用更强(P<0.01).结论 与Mfn2相比,tMfn2促进VSMC凋亡的作用更强,其机制与抑制Akt磷酸化并激活线粒体凋亡途径有关.
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低浓度乙醇对糖尿病大鼠心肌损伤后线粒体融合素2表达的影响
目的:探讨低浓度乙醇对糖尿病大鼠心肌损伤后线粒体融合素2(mfn2)表达的影响.方法:糖尿病大鼠模型采用链脲佐菌素55mg/kg腹腔注射,分为正常对照组(Control组),糖尿病组(DM组)和糖尿病+乙醇组(DM+EtOH组)(n=6);糖尿病+乙醇组于造模成功1周后给予2.5％乙醇日常饮用,1周后改为5％的乙醇持续至8周,8周后行离体心脏灌流,测定心室血流动力学指标,应用自动生化分析仪测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和天门冬氨酸转移酶(AST)的水平.Western blot测定左心室组织线粒体融合素2(mfn2)蛋白表达,免疫组化测定心肌组织mfn2蛋白表达.结果:与control组大鼠心肌相比,DM组大鼠心率、左室发展压、左室做功下降,左室舒张末压抬高,血清LDH及AST升高明显,心室mfn2蛋白表达降低;与DM组大鼠心肌相比,DM+ EtOH组明显促进心率、左室发展压、左室做功的恢复,降低左室舒张末压,同时降低LDH的水平和AST的释放,mfn2的蛋白表达增高.结论:糖尿病大鼠心肌损伤时,心肌mfn2表达降低;低浓度乙醇增强mfn2在心肌组织中的表达,提示mfn2的增加可能参与低浓度乙醇对糖尿病诱发的心肌损伤的保护作用.
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睾酮抑制大鼠血管平滑肌细胞表型转化和增殖
目的：研究睾酮对氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞( VSMCs)表型转化和增殖的抑制作用,并探讨其可能机制。方法培养大鼠VSMCs,将细胞分为对照组、ox-LDL组(50μg/ml)、血清组(10%胎牛血清)、睾酮组(5×10-8或5×10-7mol/L睾酮加50μg/ml ox-LDL)。水溶性四甲基偶氮唑盐(WST-1)法检测各组细胞增殖的变化；流式细胞仪检测各组细胞周期的变化；Western印迹法检测各组细胞线粒体融合素2蛋白(Mfn2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白(p-ERK1/2)、增殖细胞核抗原( PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及骨桥蛋白( OPN)表达水平。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞增殖能力增强(P<0.05),G0/G1期细胞比例降低(P<0.05),S期细胞比例增加(P<0.05),Mfn2和α-SMA蛋白表达降低(P<0.05),p-ERK1/2、PCNA、OPN表达增加(P<0.05)。与ox-LDL组比较,不同浓度睾酮组细胞增殖受抑制(P<0.05),G0/G1期细胞比例增加(P<0.05),S期细胞比例降低(P<0.05),Mfn2和α-SMA表达增加(P<0.05),p-ERK1/2、PCNA和OPN表达降低(P<0.05)。结论睾酮抑制ox-LDL诱导的大鼠VSMCs表型转化及增殖,可能与其上调Mfn2、抑制ERK1/2信号通路有关。
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辛伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡及线粒体融合素2表达的影响
目的：探讨辛伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡及线粒体融合素2(Mitofusin 2，Mfn2)表达的影响。方法：选取32只Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注模型组(模型组)、5 mg辛伐他汀组、10 mg辛伐他汀组，每组8只。5 mg辛伐他汀组、10 mg辛伐他汀组分别于术前7 d开始给予5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)的辛伐他汀灌胃，假手术组、模型组均给予等量蒸馏水灌胃。采用结扎左前降支法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。各组于造模后3 h剪取心脏组织，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Western Blot法检测p-Akt的表达，免疫组织化学法检测Mfn2的表达。结果：与假手术组相比较，模型组心肌细胞凋亡指数、Mfn2的表达明显升高，p-Akt的表达显著降低(均P＜0.05)；与模型组比较，5 mg辛伐他汀组、10 mg辛伐他汀组心肌细胞凋亡指数、Mfn2的表达显著降低，p-Akt的表达显著升高(均P＜0.05)，并显示出明显剂量依赖性(P＜0.05)。结论：辛伐他汀可有效抑制心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡，抑制Mfn2表达是其可能作用机制。
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线粒体融合素2通过Ras-PI3K-Akt信号途径抑制缺血再灌注诱导的乳鼠心肌细胞凋亡
目的:研究线粒体融合素2 (Mfn2)基因对缺血再灌注诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.方法:乳鼠心肌细胞经缺氧/复氧(H/Re)处理模拟心肌缺血再灌注损伤.用Mfn2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2)感染经缺氧复氧处理的乳鼠心肌细胞.采用TUNEL染色、ELISA、流式细胞术等方法检测Mfn2对缺血再灌注诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响.Western blot分析线粒体凋亡路径中Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase-9以及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达变化.结果:TUNEL染色发现Adv-Mfn2感染乳鼠心肌细胞后,细胞凋亡较H/Re组和Adv-LacZ组显著减少.ELISA和流式细胞仪检测结果表明,Adv-Mfn2组心肌细胞凋亡较H/Re组及Adv-LacZ组明显减少,且这一作用呈时间依赖性.Western blot结果显示,Adv-Mfn2组中Bcl-2蛋白表达较H/Re组和Adv-LacZ感染组上升,Bax蛋白表达下降,各组中Caspase-9的表达变化与Bax相同,Adv-Mfn2组的p-Akt蛋白表达水平则较H/Re组和Adv-LacZ感染组明显上升.结论:Mfn2基因主要通过正向调控Ras-PI3K-Akt信号通路,促进Akt的磷酸化水平,使Bcl-2蛋白表达量增加,Bax蛋白表达量降低,抑制Caspase-9活化,从而抑制缺血再灌注诱导的乳鼠心肌细胞凋亡.
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线粒体融合素2在糖尿病大鼠心肌损伤中的变化
目的:探讨线粒体融合素2 (mitofusin 2,Mfn2)在糖尿病大鼠心肌损伤中的变化.方法:腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型,分为正常组、糖尿病4周组和糖尿病8周组.测定血流动力学指标、大鼠心系数；自动生化分析仪测定血浆肌酸激酶同工酶(creatine kinase isozyme,CK-MB)水平.RT-PCR检测左室心尖部组织Mfn2的表达.结果:与正常大鼠相比,糖尿病4周、8周大鼠左室发展压、左室大上升和下降速率、心率、左室做功均明显下降(P＜0.05,P＜0.01),心室舒张末压上升(P＜0.01),心系数(HW/BW)明显增加(P＜0.01),血浆CK-MB水平升高(P＜0.05,P＜0.01),Mfn2mRNA的表达降低(P＜0.01)；与糖尿病4周相比,糖尿病8周大鼠左室发展压、左室大上升速率和下降速率、心率及左室做功进一步下降(P＜0.05,P＜0.01),心室舒张末压升高(P＜0.01),HW/BW、CK-MB水平持续性升高(P＜0.01),Mfn2 mRNA的表达进一步降低(P＜0.01).结论:随着糖尿病病程的延长,糖尿病大鼠心室功能进一步下降,其机制可能与Mfn2的表达降低有关.
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瑞舒伐他汀对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生及线粒体融合素2表达的影响
目的 研究瑞舒伐他汀对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生及线粒体融合素2表达的影响.方法 选取雄性Wistar大鼠32只,随机分为假手术组、模型组、瑞舒伐他汀1组和瑞舒伐他汀2组,每组8只.瑞舒伐他汀1组于术前3天开始每日给予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃,瑞舒伐他汀2组每日给予20 mg/kg灌胃,模型组以蒸馏水灌胃,随后制备颈动脉球囊损伤模型.建模后14天处死大鼠取颈动脉,HE染色行组织形态学观察,测量内膜/中膜面积比；免疫组织化学、免疫印迹法检测线粒体融合素2和增殖细胞核抗原的表达；依文思蓝染色观察血管内皮修复.结果 与假手术组比较,模型组、瑞舒伐他汀1组和瑞舒伐他汀2组血管内膜增生,内膜/中膜面积比值显著增加(P＜0.01),增殖细胞核抗原阳性细胞比值显著增加(P＜0.01),线粒体融合素2表达显著降低(P＜0.o1)；与模型组比较,瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组血管内膜/中膜面积比值显著降低(P＜0.01),增殖细胞核抗原阳性细胞比值显著降低(P＜0.01),线粒体融合素2表达显著增高(P＜0.05),且瑞舒伐他汀2组较瑞舒伐他汀1组变化更显著(P＜0.01).依文思蓝染色显示,瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组再内皮化程度显著好于模型组(P＜0.05).结论 瑞舒伐他汀可抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,同时促进内皮修复,其作用可能与上调线粒体融合素2表达有关.
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睾酮对去势大鼠血管平滑肌细胞线粒体损伤的影响
目的：研究生理剂量睾酮对去势大鼠主动脉血管平滑肌细胞线粒体损伤的保护作用，并探讨其可能机制。方法选取8周龄雄性 SD 大鼠30只，随机分为假手术组，去势组和去势﹢睾酮组，每组10只。去势组行睾丸切除术，去势﹢睾酮组在去势后每天给予丙酸睾酮5.0 mg/ kg 肌肉注射。12周后测定各组血清睾酮浓度，并取大鼠胸主动脉，免疫印迹法检测血管平滑肌组织线粒体融合素2蛋白表达，激光共聚焦显微镜观察线粒体形态变化；JC -1检测线粒体膜电位；测定细胞总三磷酸腺苷（ATP）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH - Px）活性以及丙二醛（MDA）水平。结果与假手术组比较，去势组大鼠血清睾酮水平降低（ P ＜0.05），线粒体融合素2表达降低（P ＜0.05），线粒体聚集呈团块状，线粒体膜电位减低（P ＜0.05），ATP 含量、SOD 和GSH - Px 活性降低（P ＜0.05），MDA 水平增加（P ＜0.05）。与去势组相比，去势﹢睾酮组大鼠血清睾酮水平升高（P ＜0.05），线粒体融合素2表达增加（P ＜0.05），线粒体呈管状分布，线粒体膜电位增高（P ＜0.05），ATP 含量、SOD 和 GSH - Px 活性增加（P ＜0.05），MDA 水平降低（P ＜0.05），与假手术组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。结论生理剂量睾酮可维持去势大鼠血管平滑肌细胞的线粒体形态和膜电位水平，增加细胞 ATP 含量，降低氧化应激水平，对线粒体损伤具有保护作用，上调线粒体融合素2表达是其可能机制之一。
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丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的机制研究
目的 探索丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的机制.方法 选取32只SD大鼠,按随机数字表法分为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA40 mg组,每组8只.丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组分别于术前7d开始给予20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液腹腔注射.假手术组、缺血再灌注模型组均给予等量蒸馏水腹腔注射.采用结扎左前降支法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.各组于造模后3h剪取心脏组织,采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,Western bolt法检测p-Akt表达,免疫组化法检测Mfn2表达.结果 与假手术组相比较,模型组心肌细胞凋亡指数、Mfn2表达显著升高,p-Akt表达显著降低(P＜0.05);与模型组相比较,丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA40 mg组心肌细胞凋亡指数、Mfn2表达显著降低,p-Akt表达显著升高(P＜0.05),并显示出明显剂量依赖性.结论 丹参酮ⅡA可有效抑制心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡,抑制Mfn2表达是其可能的作用机制.
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睾酮抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞表型转化和增殖
目的 研究睾酮对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖的抑制作用,并探讨其可能机制.方法 培养大鼠VSMC,利用血清饥饿法进行同步化处理.将细胞分为对照组:不进行任何处理;ox-LDL组:给予50 μg/mL ox-LDL处理;睾酮组:分别加入5×10-8mol/L和5×10-7 mol/L睾酮预处理12 h,然后与50 μg/mL ox-LDL共培养;另外设置血清组,用含100 mL/L胎牛血清的培养基培养.水溶性四甲基偶氮唑盐(WST-1)法检测各组细胞增殖的变化;流式细胞术检测各组细胞周期的变化;Western blot法检测各组细胞线粒体融合素2(Mfn2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及骨桥蛋白(OPN)表达的变化.结果 与对照组比较,ox-LDL组细胞增殖能力增强,G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加,Mfn2表达降低,p-ERK1/2表达增加,PCNA表达增加,α-SMA表达降低,OPN表达增加.与ox-LDL组比较,不同浓度睾酮组细胞增殖受抑制,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低,Mfn2表达增加,p-ERK1/2表达降低,PCNA表达降低,α-SMA表达增加,OPN表达降低,以上作用呈现一定的浓度依赖性.结论 睾酮可抑制ox-LDL诱导的大鼠VSMC发生表型转化及增殖,可能与其上调Mfn2抑制ERK1/2信号通路有关.
