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ERβ1基因及其剪切变异体真核表达载体的构建与鉴定
目的应用基因克隆技术构建雌激素受体β1（ERβ1）及其5-8外显子缺失变异体ERβ△5-8（文中简称ERβ△），为ERβ功能的研究奠定基础。方法组织中提取总RNA，RT-PCR法扩增基因ERβ1及ERβ△，限制性酶切并克隆于以带EGFP绿色荧光基因及Myc报告基因的非融合真核细胞表达质粒IRES2-EGFP，菌群转化扩增后琼脂糖凝胶电泳，限制性酶切后行DNA测序鉴定。结果 PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明ERβ1长度为1593 bp，ERβ△长度为972 bp，与GeneBank上公布的蛋白编码区序列一致。结论成功构建ERβ1基因及其剪切变异体ERβ△真核表达载体。
关键词： 基因克隆 质粒 雌激素受体β(ERβ) -
雌激素受体β与乳腺癌中关系的研究进展
目的 探讨雌激素受体β(ER β)与乳腺癌关系的研究进展.方法 采用文献回顾分析方法,对ER β的功能、分型,及其乳腺癌发生、发展、预后评估及内分泌治疗反应方面的可能作用加以综述.结果 ER β可能在乳腺癌发生中的作用、对预后及内分泌治疗反应方面具有重要作用.结论 虽然ER β研究结果不一致,但仍是一种新的乳腺癌预后评估指标.
关键词： 雌激素受体β(ERβ) 乳腺癌 -
慢病毒介导短发夹ShRNA沉默ERβ乳腺癌细胞株的建立
目的:利用慢病毒载体短发夹RNA(shRNA)介导人乳腺癌细胞ERβ基因沉默,筛选鉴定,并建立ERβ基因稳定下调的乳腺癌细胞株.方法:将靶向沉默ERβ基因的shRNA慢病毒颗粒感染人乳腺癌细胞株T47D和MCF-7,以未感染及空载体慢病毒感染的T47D和MCF-7细胞分别作为空白对照和阴性对照.先以慢病毒瞬转48 h,通过蛋白免疫印迹法(western-blot)进行蛋白水平检测筛选出干扰效果好的两组,然后继续经浓度为1 mg/L的嘌呤霉素连续筛选4周,采用RT-PCR和western-blot方法,分别对ERβ在mRNA和蛋白水平上的沉默效果进行鉴定.结果:慢病毒感染乳腺癌细胞后,与阴性对照组相比,实验组ERβmRNA和蛋白表达量均明显下降(P(0.05);其中T47D细胞株shRNA3326、3327两实验组下调效果明显,ERβmRNA水平和蛋白水平分别达到(61.12±3.66)％、(76.47± 3.16)％和(60.83± 3.07)％、(53.31±3.00)％；MCF-7细胞株shRNA3325、3326两实验组下调效果显著,ERβmRNA水平和蛋白水平下调率分别为(62.42± 0.07)％、(42.49±1.96)％和(83.69± 5.07)％、(73.16± 13.21)％.而阴性对照与空白对照组相比无显著性差异,无统计学意义(P＞0.05).结论:成功筛选并建立了ERβ基因稳定下调的两株乳腺癌细胞系T47D和MCF-7,从而为后续探究改变ERβ表达水平在乳腺癌发生发展及在乳腺癌内分泌治疗效果中的作用提供有用的细胞研究模型.
关键词： 雌激素受体β(ERβ) 乳腺癌细胞株 短发夹状RNA 慢病毒 感染 -
比格犬雌激素受体β的原核表达、纯化及鉴定
目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致；优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2％葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2％葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.
关键词： 比格犬 雌激素受体β(ERβ) 原核表达 -
雌激素受体β对牙周膜成纤维细胞RANKL表达的影响
目的:研究雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament,HPLF)核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响.方法:采用基因干涉方法抑制了HPLF细胞中ERβ基因的表达,用雌激素干预ERβ抑制的和未抑制的HPLF细胞,研究细胞RANKL表达的情况.结果:雌激素明显降低了ERβ抑制的HPLF细胞RANKL的表达,但对ERβ未抑制的HPLF细胞RANKL的表达没有显著影响.结论:雌激素可能通过ERβ抑制牙周膜成纤维细胞RANKL的表达.
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雌激素受体β对牙周膜成纤维细胞OPG表达的影响
目的:研究雌激素受体β(ERβ)对人牙周膜成纤维细胞(HPLF)的骨保护因子(OPG)表达的影响.方法:合成ERβ基因的干涉载体,以脂质体法转染至HPLF中,Western blot及RT-PCR法检测转染效率.鉴定后用雌激素干预ERβ十涉载体转染和未经转染的HPLF,研究细胞OPG的表达情况.结果:ERβ干涉载体可特异地抑制HPLF中ERβ的表达.雌激素明显增强了未转染的HPLF的OPG表达,但对稳定转染的HPLF的OPG表达没有显著影响.结论:雌激素主要通过ERβ促进人牙周膜成纤维细胞OPG的表达.
关键词： 牙周膜成纤维细胞 雌激素受体β(ERβ) 基因干涉 OPG -
ERβ与其变异体对三阴性乳腺癌细胞株生长的影响
目的 通过对三阴性乳腺癌细胞转染雌激素受体β (ERβ)及其5-8外显子缺失异构体ERβ△5-8(文中简称ERβ△),试图了解ERβ单独表达对癌细胞生长的影响,及对雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)作用的反应性；探讨ERβ是否有可能成为三阴性乳腺癌内分泌治疗的预测因子和新的治疗靶点.方法 ①构建真核细胞表达克隆pReceiver-M72-ER β及其剪切体pReceiver-M72-ER β△.②脂质体法转染人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,设ERβ组、ERβ△组、空载体组及空白对照四组.③转染后荧光显微镜检,免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等方法验证蛋白表达.按实验设计分别加入不同药物浓度的三苯氧胺、雌激素.④流式细胞术观察细胞周期情况.MTT法检测细胞相对活性.结果 ①以IRES2-EGFP为蓝本改造的pReceiver-M72-ERβ及其剪切体pReceiver-M72-ERβ△成功构建.②转染ERβ后细胞生长速度加快,细胞周期中G1期比例减少,S期比例增加,克隆形成能力增强；转染ERβ△后细胞系相对活性及细胞周期未见明显改变；雌激素及tamoxifen对转染ER β及其剪切体ERβ△的细胞生长无明显影响.结论 ERβ单独表达促进MDA-MB-231细胞生长,增加细胞相对活性及克隆形成能力；转染ERβ的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中对雌激素及雌激素抑制剂tamoxifen无明显反应.
关键词： 雌激素受体β(ERβ) 转染 三阴性乳腺癌 内分泌治疗 -
雌二醇通过与雌激素受体β结合抑制骨关节炎滑膜细胞的NF-κB通路发挥抗炎作用
目的 探讨雌二醇在骨关节炎病程中对滑膜细胞产生抗炎作用的机制.方法 分离并鉴定滑膜细胞,利用免疫荧光染色观察滑膜细胞表达雌激素受体β(ERβ)的情况;而后对滑膜细胞进行分组:空白对照组,10 ng/mL白细胞介素1β(IL-1β)处理组、雌二醇处理组(用10 ng/mL IL-1β预处理同时,添加10-7 mol/L的雌二醇培养)、雌二醇联合雌激素受体阻断剂四氢大麻酚(THC)处理组(用10 ng/mL IL-1β预处理同时,添加10-7 moL/L雌二醇和10-5 mol/L THC),各组处理36 h.实时定量PCR检测滑膜细胞中核因子κB抑制蛋白β(IκBα)和IL-6的mRNA水平,Western blot法检测滑膜细胞中IκBα和IL-6的蛋白水平.结果 骨关节炎滑膜细胞中有ERβ表达;IL-1β组IL-6的mRNA和蛋白水平表达均增高;IκBα蛋白水平降低,而mRNA水平升高,同时磷酸化IκBα蛋白水平升高;与IL-1β组相比,IL-1β联合雌二醇组,IL-6、IκBα、p-IκBα蛋白及mRNA水平下降.用IL-1β、雌二醇、雌激素受体阻断剂三者联合组,则可见IL-6、IκBα、p-IκBα蛋白及mRNA水平较IL-1β处理组无明显变化.结论 雌二醇通过结合ERβ抑制NF-κB通路激活从而发挥抗炎作用.
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ERβ基因敲除对小鼠阴茎海绵体eNOS-NO通路基因表达的影响
目的:探讨雌激素受体β(ERβ)基因敲除对小鼠阴茎海绵体eNOS-NO通路基因表达的影响.方法:选取ERβ基因敲除(ERβKO)雄性小鼠和相应野生型雄性小鼠各12只,随机分为4组:正常对照组(A组)、ERβKO组(B组)、野生型+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理组(C组)和 ERβKO+TNF-α处理组(D组).C组和D组每日给予TNF-α6μg/kg腹腔注射,A组及B组则以等量生理盐水替代,连续14d.采用RT-PCR技术检测小鼠阴茎组织通路相关分子:eNOS、小窝蛋白-1(caveolin-1)、钙调蛋白(Cam)mRNA表达情况；Western blotting检测小鼠阴茎组织eNOS-NO通路相关分子蛋白表达水平的变化情况.结果:RT-PCR结果与Western blotting 结果相符:与A组相比,B组eNOS、Cam表达减少,小窝蛋白-1表达上调(P＜0.05); TNF-α给药后,与C组比较,D组的eNOS、Cam表达减少,小窝蛋白-1表达上调(P＜0.05).结论:ERβ基因敲除后,尤其在内皮损伤因素TNF-α作用下,eNOS-NO通路表达下调,提示ERβ对阴茎海绵窦内皮具有保护效应.
