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葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究
目的了解临床分离凝固酶阳性和阴性葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制. 方法应用PCR-RFLP、PCR-SSCP技术及利血平逆转实验,检测gyrA基因的突变及norA基因的表达.结果 40株凝固酶阳性(70.2%)和28株凝固酶阴性葡萄球菌(77.8%)检出gyrA基因84位点突变;4株未检测出84位点突变的菌株SSCP带型与标准菌株SA42和SA42R均不同;利血平逆转实验发现88%的凝固酶阳性和72%凝固酶阴性葡萄球菌存在norA耐药表型;36株凝固酶阳性和20株凝固酶阴性葡萄球菌涉及两种耐药机制.结论 gyrA基因84位点突变可能是喹诺酮类药物靶位耐药的重要途径之一,其他位点突变也可能存在;多数临床耐药分离株靶位改变和膜耐药双重耐药机制共存.
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氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌norA基因表达的影响研究
目的 研究氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌norA基因表达的影响.方法 荧光测定法研究氟喹诺酮类药物在临床分离的金黄色葡萄球菌SAUz及其诱导耐药菌中的蓄积量及能量抑制剂羰氰氯苯腙(CCCP)对蓄积量的影响,应用狭线杂交法检测细菌norA基因转录水平.结果 氟喹诺酮类药物在诱导耐药菌SAUz-16中的蓄积量明显低于其亲代株SAUz,加入CCCP后,亲水性氟喹诺酮类药物在SAUz-16菌体中蓄积量增加,但仍未达到亲代株的稳态水平,诱导耐药菌SAUz-16 norA基因转录水平高于其亲代菌SAUz.结论 氟喹诺酮类药物可导致norA基因表达增加,norA基因表达增加导致的氟喹诺酮类药物泵出增加是药物在金黄色葡萄球菌菌体内蓄积量减少的原因之一.
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norA基因mRNA表达水平与表皮葡萄球菌氟喹诺酮耐药性的关系
目的:探讨表皮葡萄球菌多药转运蛋白norA基因表达水平与氟喹诺酮耐药性的关系.方法:收集临床分离表皮葡萄球菌菌株,用纸片扩散法(Kirby-Bauer)检测50株表皮葡萄球菌对抗茵药物的敏感性,筛选出耐药和敏感菌株,以标准菌株ATCC12228作为对照;提取表皮葡萄球菌的总RNA,应用荧光实时定量RT-PCR检测表皮葡萄球茵多药转运蛋白norA基因mRNA表达水平.结果:所有菌株均检测到norA基因,临床分离耐药菌株norA基因mRNA表达水平明显高于敏感菌株,统计学分析差异有显著性(P＜0.05).结论:对氟喹诺酮类耐药的表皮葡萄球菌norA基因过度表达,其可能是表皮葡萄球茵耐药的原因之一.
关键词： 表皮葡萄球茵 实时定量RT-PCR norA基因 氟喹诺酮类药物 -
野生型金黄色葡萄球菌株norA基因敲除菌株的构建及其耐药性变化
目的 探讨norA基因在野生型金黄色葡萄球菌多重耐药中的作用.方法 用DNA重组技术构建金黄色葡萄球菌norA基因敲除株并测定其对3种喹诺酮类抗生素的小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值.结果 成功构建了野生型金黄色葡萄球菌株的norA基因敲除菌株,且其MIC值均有一定程度下降.结论 norA基因在金黄色葡萄球菌多重耐药中起一定的作用.
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金黄色葡萄球菌的多重耐药转运蛋白NorA
金黄色葡萄球菌的NorA蛋白是一种跨膜多重药物外排蛋白,介导了金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药.NorA蛋白属于细菌转运系统中的主要易化族类,由位于染色体上的norA基因编码.norA基因大小约为1.8kb,编码388个氨基酸构成的多肽.NorA蛋白富含疏水性氨基酸,可能构建了亲水性氟喹诺酮类药物的膜相关性活性外排泵,主要介导了亲水性氟喹诺酮类药物从细胞中主动排出,研究认为这主要是由于膜上NorA蛋白数量的增加造成的.目前norA超水平表达的调控机制尚不清楚,部分人认为是norA基因多处位点或(和)启动子区域发生突变,影响了norA的表达.已证明利血平、维拉帕米和5'-methoxyhydnocarpin等是NorA外排蛋白的抑制剂,能增强亲水性氟喹诺酮类药物的抗菌活性,降低耐药率.
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金黄色葡萄球菌norA基因的研究
目的研究norA基因介导的金葡菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制.方法PCR法制备DIG-norA基因探针;点杂交及狭线杂交检测细菌norA基因及其转录水平.结果所有实验菌株均检测到norA基因;诱导耐药菌SA2-16的norA基因转录水平明显高于其亲代株,临床分离耐药菌norA基因转录水平略高于敏感菌,但统计学分析无显著性差异,细菌在环丙沙星1/10MIC浓度中生长,未见norA基因转录增加.结论norA基因可能为金葡菌的结构基因,诱导耐药菌药物泵出增加的原因在于norA基因转录的增加,norA基因介导的耐药在不同的耐药菌株中所起的作用并不相同.
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金葡菌多重耐药基因norA的原核表达及其抗体制备
按金葡菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物,以金葡菌基因组DNA为模板,扩增出基因norA中约1155bp的cDNA片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化到感受态大肠埃希菌JM109中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经Nde I和Xho I酶切,回收1155bp的目的片段,定向克隆到pET-28a(+)表达载体中,转化至感受态大肠埃希菌DH5α中,提取质粒,再次转化到BL21(DE3)中,成功筛选到阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出norA部分基因的表达.利用得到的纯化蛋白免疫家兔,并通过间接ELISA法检测抗体效价,证明得到相应抗体.
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介导对氟喹诺酮类药物耐药的金黄色葡萄球菌norA基因的研究
目的 研究导致对氟喹诺酮类药物耐药的金葡菌norA基因的介导机制.方法 K-B纸片扩散法测定细菌敏感性(Kirby-Bauer法),研究两种FQNS在菌体内的蓄积量,通过Real-time PCR方法检测金黄色葡萄球菌norA基因的表达.结果 两种药物在敏感菌菌体内的稳态蓄积浓度明显高于耐药菌,所有实验菌株中均检测到norA基因的存在,经RealTime PCR扩增后,检测到高度耐药菌株的norA基因表达量较敏感菌菌株平均norA基因表达量高0～8倍；中度耐药菌株的norA基因表达量较敏感菌株高5～17倍.结论 推测norA基因表达增加是菌体内药物蓄积量减少的主要原因之一；部分菌株的耐药可能没有norA基因参与,即使有norA基因参与,起作用也不相同；可能有其他外排泵共同参与金葡菌的耐药.
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金黄色葡萄球菌norA基因探针的制备
目的研究制备norA基因介导的金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制的Dig-norA基因探针.方法采用聚合酶链反应(PCR)制备Dig-norA基因探针.结果PCR法制备Dig-norA基因探针简便易行,可在较短时间内获得大量的探针,所得探针有较高的敏感性;Dig-norA基因探针安全、易操作,标记探针可长期保存.结论为进一步研究norA基因介导的耐药机制提供了一种手段.
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烧伤创面耐药金黄色葡萄球菌的分离及其norA基因突变分析
目的 探讨野生型耐药金黄色葡萄球菌的norA基因及其启动子的突变情况.方法 分离并筛选出10株烧伤刨面的耐药性金黄色葡萄球菌,对norA基因及其启动子进行测序并分析其改变.结果 共分离出金黄色葡萄球菌87株,它们对万古霉素100%敏感,对奎奴普汀和呋喃妥因也有很高的敏感性,而对其余抗生素的耐药率则非常高;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的阳性率达到91.7%.所有10株实验菌的norA基因编码区都有1 349位G→A的点突变,也就是氨基酸的291位处存在Gly(甘氨酸)→A8p(天冬氨酸)的突变.利血平逆转实验提示10株细菌对三种抗生素的MICs值均存在不同程度的下降.结论 norA基因突变是金黄色葡萄球菌耐药的机制之一.
