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鸦胆子苦醇抑制结直肠癌细胞增殖与Nrf2通路相关性研究
目的 鸦胆子苦醇(brusatol,BRU)系苦木科植物鸦胆子果实中提取的一种苦木内酯类化合物,近年来被发现能有效抑制肺癌细胞的Nrf2通路,在抗肿瘤治疗中的应用潜力受到关注.本研究着重探讨BRU对结直肠癌细胞增殖和Nrf2通路的影响.方法 采用不同浓度BRU处理HCT116和HT29细胞,MTT法检测细胞活力,台盼蓝染色观察细胞增殖,Hoechst 33342单染和AnnexinⅤ/PI双染检测凋亡,PI单染检测细胞周期,BrdU免疫荧光法研究DNA的合成,试剂盒法检测细胞内还原性辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和GSH水平.蛋白质印迹法检测BRU对HCT116细胞Nrf2蛋白表达的影响,QRT-PCR法检测BRU对Nrf2靶基因6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phospho gluconat dehydrogenase,6GPD)、异柠檬酸脱氢酶同工酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)和苹果酸酶1(malic enzyme 1,ME1)转录水平的影响.结果 MTT结果显示,15～240 nmol/L的BRU处理可降低HCT116细胞和HT29细胞的活力.用60和240 nmol/L的BRU分别处理HCT116和HT29细胞48 h,能显著抑制细胞增殖.BrdU免疫荧光结果显示,BRU处理24 h能显著抑制2种细胞的DNA合成,抑制率分别达到(76.64±6.78)％和(62.87±8.62)％,t值分别为8.615和5.852,P值分别为0.002和0.005.凋亡检测结果显示,BRU在60 nmol/L条件下未明显诱导HCT116细胞凋亡.用60 nmol/L的BRU处理HCT116细胞,能使Nrf2蛋白水平在2和4 h分别减少(48.67±3.21)％和(43.67±11.85)％,t值分别为10.382和2.133,P值分别为0.001和0.025.另外,60 nmol/L的BRU处理8 h还能显著降低结肠癌细胞NADPH和GSH的水平.QRT-PCR法检测结果显示,BRU能在8 h内时间依赖性的抑制HCT116细胞Nrf2靶基因G6PD、6GPD、IDH1和ME1的转录.结论 BRU可以快速而短暂的抑制结肠癌细胞Nrf2信号通路,在不明显诱导细胞凋亡的条件下有效抑制细胞增殖.BRU对结肠癌细胞增殖的抑制作用可能与Nrf2信号通路有关.
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鸦胆子苦醇联合长波紫外线辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的影响研究
目的 观察鸦胆子苦醇联合长波紫外线(UVA)辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制.方法 人恶性黑色素瘤A375细胞分为空白组、对照组和实验组.空白组细胞不做任何处理,对照组用75 kJ·m-2长波紫外线处理,实验组在75 kJ· m-2长波紫外线处理2h后分别加入10,20,50,100,200nmol·L-1的鸦胆子苦醇.检测各组细胞活性、细胞周期及凋亡率,检测人转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)通路及线粒体凋亡途径相关蛋白表达情况.结果 对照组和实验组细胞活性均显著低于空白组,50,100,200 nmol·L-1实验组细胞活性均显著低于对照组,且随鸦胆子苦醇作用浓度增大而逐渐降低(P＜0.05或P＜0.01).对照组和10,20,50,100,200 nmol·L-1实验组细胞凋亡率分别为(3.21±0.24)％,(3.45±0.26)％,(5.86±0.42)％,(12.62±1.12)％,(13.02 ±2.24)％,(16.15±2.78)％,均显著高于空白组的(0.89±0.12)％,20,50,100,200 nmol·L-1实验组细胞凋亡率均明显高于对照组(均P＜0.01).对照组和实验组与空白组比较,人恶性黑色素瘤A375细胞G0/G1期细胞比例逐渐升高,G2/M和S期细胞比例逐渐降低(P＜0.05或P＜0.01).空白组、对照组和50 nmol·L-1实验组Nrf2蛋白相对表达量分别为1.69±0.23,1.23±0.24,1.03 ±0.15,谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)蛋白相对表达量分别为2.43±0.16,2.89±0.18,2.78±0.21,B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达量分别为0.59±0.14,1.05±0.21,1.59±0.24,胱天蛋白酶-3(caspase-3)蛋白相对表达量分别为2.63±0.15,2.71±0.26,2.63±0.28.与空白组比较,对照组和实验组人恶性黑色素瘤A375细胞Nrf2蛋白表达相对量降低,Bax和GSTP1蛋白表达相对量升高,caspase-3无明显变化.结论 鸦胆子苦醇联合UVA辐射可抑制人恶性黑色素瘤A375细胞增殖,且存在一定的量效关系,与抑制Nrt2信号通路及激活线粒体凋亡途径相关蛋白,加速细胞凋亡有关.
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鸦胆子苦醇对非小细胞肺癌Nrf2-Notch1信号轴的影响机制研究
目的 探讨鸦胆子苦醇在非小细胞肺癌A549、H460细胞增殖中的作用.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测鸦胆子苦醇对A549、H460细胞的半数抑制浓度(IC50);Hoechst33258染色,倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化;通过CCK-8法检测细胞活力;Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blot免疫印迹法检测A549、H460细胞Nrf2、Notch1蛋白表达.结果 鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞的IC50分别为(0.70±0.03)、(0.47±0.05) μmol/L;流式细胞试验结果显示,鸦胆子苦醇处理后A549、H460细胞凋亡率显著升高,与对照组比较差异均有高度统计学意义(均P＜ 0.01);Western blot检测结果显示,鸦胆子苦醇可降低细胞内Nrf2、Notch1的蛋白表达.结论 鸦胆子苦醇可以抑制A549、H460细胞的生长,其机制可能与抑制Nrf2-Notch1信号轴有关.
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鸦胆子苦醇抑制人非小细胞肺癌A549细胞转移的机制
目的：探讨鸦胆子苦醇对人非小细胞肺癌A549细胞转移能力的抑制作用及其机制。方法采用 Reed-Muench法计算鸦胆子苦醇对A549细胞的半数致死浓度（LC50）；通过CCK-8测定细胞活力绘制增殖曲线和流式细胞周期测定鸦胆子苦醇对A549细胞增殖能力的影响；采用Transwell法检测鸦胆子苦醇对A549细胞株转移的抑制情况，以及在半数致死浓度的鸦胆子苦醇浓度下不同时间对细胞转移的抑制率；应用Western印迹法检测细胞转移相关蛋白的表达情况。结果非小细胞肺癌 A549细胞的增殖能力在鸦胆子苦醇处理后基本没有变化；鸦胆子苦醇处理后A549细胞的转移能力与对照组相比明显下降，且在一定作用时间范围内有时间依赖性；肿瘤转移相关蛋白（BRF）2、胰岛素样生长因子结合蛋白-2（ IGFBP-2）、CD151的表达水平在鸦胆子苦醇处理后的细胞中明显下调。结论鸦胆子苦醇是潜在的抗非小细胞肺癌的药物，有必要进一步阐明其抗非小细胞肺癌的分子机制，为临床治疗提供一定的指导意义。
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鸦胆子苦醇通过调节细胞骨架力学性质抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的侵袭行为
目的 研究鸦胆子苦醇对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)细胞骨架力学性质的调控以及对RA FLS侵袭行为的影响.方法 细胞骨架染色法检测鸦胆子苦醇对RA FLS细胞骨架力学性质的调控;Transwell小室法检测鸦胆子苦醇对RA FLS细胞骨架的调控和对RA FLS侵袭行为的影响;酶谱和Western blotting法检测鸦胆子苦醇对RA FLS中MMP-2、MMP-3表达的影响.结果 通过细胞骨架染色并在显微镜下观察发现,鸦胆子苦醇可显著减少RA FLS伪足数量的产生,通过调节细胞骨架网络的力学性质抑制细胞的运动能力,鸦胆子苦醇可抑制RA FLS的侵袭并能下调MMP-2、MMp-3的表达水平.结论 鸦胆子苦醇能调节RA FLS的细胞骨架的力学性质并抑制细胞的侵袭行为,同时鸦胆子苦醇可通过降低MMP-2、MMP-3的表达抑制RA FLS的侵袭.研究结果为进一步开发治疗RA的新药物提供了相应实验依据.
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鸦胆子苦醇阻滞小鼠早期胚胎发育的作用机制
目的 截止目前,鸦胆子苦醇在小鼠早期胚胎发育中的作用及其作用机制仍不清楚.文中旨在探究鸦胆子苦醇对小鼠早期胚胎发育的影响及其可能的作用通路. 方法 取100只健康清洁级昆明小鼠(雌鼠80只,雄鼠20只)分为6组:阴性对照组(不添加DMSO)、空白对照组(新鲜CM中培养添加等量DMSO)以及20nmol/L鸦胆子苦醇组、50nmol/L鸦胆子苦醇组、100nmol/L鸦胆子苦醇组、200nmol/L鸦胆子苦醇组(用CM分别稀释鸦胆子苦醇浓度为20、50、100、200nmol/L).每组每次平均使用20枚胚胎,重复4次.受精卵培养24、48、72、96h分别为2-细胞期、4-细胞期、桑葚胚期和囊胚期.观察各组各期发育率并筛选出适浓度,并通过免疫荧光染色检测核因子E2相关因子2 (Nrf2)的定位,实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别比较G2/M期Cyclin B,CDK1 mRNA水平以及Nrf2蛋白表达的变化. 结果 在4-细胞期,20、50、100nmol/L鸦胆子苦醇组胚胎发育率[(75.0±2.8)%、(30.4±7.5)%、(4.2±5.9)%]较阴性对照组[(93.0±2.8)%]、空白对照组[(90.9±1.2)%]显著降低(P<0.05).在桑葚胚期,与阴性对照组、空白对照组桑葚胚形成率[(83.5±2.1)%、(84.2±1.2)%]比较,50nmol/L鸦胆子苦醇组[(19.3±13.1)%]显著降低[(79.00±0.06)% vs 100%,P<0.05].50nmol/L鸦胆子苦醇组Nrf2蛋白的表达较空白对照组显著降低(P<0.05).50nmol/L鸦胆子苦醇组G2/M期Cyclin B[(59.5±9.2)%]、CDK1 mRNA[(56.0±1.4)%]的表达较空白对照组(100%)显著降低(P<0.05). 结论 鸦胆子苦醇可能通过下调Nrf2,调节Cyclin B-CDK1复合物的表达影响细胞周期由G2向M期转变,进而抑制胚胎发育.
关键词： 鸦胆子苦醇 核因子E2相关因子2 早期胚胎 细胞周期停滞 -
鸦胆子不同药材及部位中鸦胆子苦醇含量分析
目的:建立中药鸦胆子苦醇的高效液相色谱检测方法,测定鸦胆子不同药材及同一药材不同部位中鸦胆子苦醇的含量.方法:采用Sepax Sapphire C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),乙腈—水溶液(体积比为40∶60)为流动相,流速为1.0mL·min 1,检测波长235nm,柱温30℃.结果:鸦胆子苦醇在质量浓度为61.6～1 060 μg·mL-1呈良好的线性关系,(r=0.9994,n=5),平均回收率为100.87％,RSD为2.01％(n=5).同一药材不同部位,仁中鸦胆子苦醇高,壳中少;对不同药材,大药材中的鸦胆子苦醇是小药材中的2.6倍.结论:本研究建立的方法重复性好,准确可靠;结果表明鸦胆子同一药材不同部位及不同质量的药材中,鸦胆子苦醇含量差异比较大.
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鸦胆子苦醇抑制黑色素瘤生长和增殖的作用机理研究
目的 研究中药鸦胆子苦醇对黑色素瘤细胞增殖和凋亡的作用机制.方法 采用细胞活力测定(MTS)不同浓度的鸦胆子苦醇对黑色素瘤A375细胞生长抑制率;应用PI单染及Annexin-V-FITC双染法流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率的变化;以DCFA-DA荧光探针标记细胞,分析活性氧簇(ROS)的产生;利用Western Blot检测Nrf2及Akt通路蛋白表达的影响.结果 鸦胆子苦醇对黑色素瘤细胞的生长抑制呈剂量依赖性;鸦胆子苦醇处理A375细胞后,细胞周期阻滞在G1期,S期减少.且鸦胆子苦醇诱导细胞细胞凋亡发生;免疫沉淀检测结果表明鸦胆子苦醇处理移植Nrf2蛋白的表达,使磷酸化Akt表达减少.结论 鸦胆子苦醇可抑制细胞增殖,并诱导ROS的生成及细胞凋亡发生.Akt途径的抑制可能是鸦胆子苦醇对A375细胞生长抑制及凋亡诱导的作用机制之一.因此,鸦胆子苦醇可能是潜在的抗黑色素瘤的药物.
