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AICAR对三阴性乳腺癌体外抑制作用及其机制的探讨
目的:探讨AMPK激活剂AICAR对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞的增殖作用及可能机制.方法:不同浓度的AMPK激活剂AICAR(0、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L)作用于TNBC细胞系MDA-MB-231后,采用MTS法检测细胞增殖,流式细胞仪检测AICAR处理后细胞周期改变,蛋白质印迹法检测pAMPK、EGFR、pERK1/2和Cyclin D1等增殖相关蛋白及细胞周期相关蛋白的表达水平.结果:不同浓度的AMPK激活剂AICAR处理乳腺癌MDA-MB-231细胞系24 h后,随着AICAR浓度的逐渐增加,对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈浓度依赖性.流式细胞结果显示,AICAR阻滞细胞进入有丝分裂期,饥饿(含0.5％血清的培养基)培养24 h后的TNBC MDA-MB-231细胞经含有AICAR(0.5与1.0 mmol/L)的FBS(含10％血清培养基)处理24 h后,细胞周期阻滞于G0/G1期,与单纯FBS处理的对照组比较,差异均有统计学意义,t值分别为5.416和5.578,P值分别为0.000 99和0.000 84；与单纯FBS处理的对照组比较,S期细胞减少,差异有统计学意义,t值分别为4.404和5.941,P值分别为0.003 14和0.000 58.同时,蛋白质印迹法检测发现,AICAR下调细胞周期蛋白Cyclin D1表达,1.0、2.0 mmol/LAICAR处理组与对照组相比Cyclin D1蛋白均明显降低.蛋白质印迹法结果还显示,经AICAR处理的MDA-MB-231细胞,AMPK通路被激活,其EGFR/AKT/ERK1/2磷酸化表达水平均明显降低,和对照组相比差异有统计学意义,P值均＜0.001.结论:AMPK激活剂AICAR对TNBC细胞有增殖抑制作用,其机制一方面可能是通过激活AMPK信号通路,抑制EGFR/pAKT/ERK通路的活化,另一方面是抑制细胞周期蛋白Cyclin D1表达,使细胞周期阻滞于G0/G1时相,阻止细胞进入S期,从而减少细胞进入有丝分裂.
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LKB1基因沉默增强AICAR诱导大肠癌HCT116细胞凋亡的作用
目的 探讨肝激酶B1 (liver kinase B1,LKB1)表达被抑制的情况下,腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)激活剂AICAR对大肠癌HCT116细胞诱导凋亡作用及相关机制.方法 采用慢病毒的方法构建LKB1敲除的HCT116-LKB1-shRNA细胞株及对照HCT116-PLKO.1细胞株.用不同浓度的AICAR作用于HCT116-PLKO.1及HCT116-LKB1-shRNA细胞,用SRB法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平及细胞周期改变,蛋白质印迹法检测pAMPK、P21、P53及caspase-3等蛋白的表达水平,比较两组细胞间的差异.结果 AMPK激活剂AICAR处理48小时后,随着AICAR浓度的升高,两组细胞的生长抑制率均逐渐升高,呈浓度依赖;而且HCT116-LKB1-shRNA细胞对AICAR的敏感性高于对照组.蛋白印迹法的结果发现,AICAR处理后两组细胞caspase-3均被激活,且HCT116-LKB 1-shRNA细胞组中的表达显著高于HCT116-PLKO.1组.细胞凋亡分析结果显示AICAR导致HCT116-LKB1-shRNA细胞的凋亡高于HCT116-PLKO.1组.细胞周期分析的结果显示,AICAR处理12小时后HCT116-PLKO.1细胞周期停滞于G0/G1期,而HCT116-LKB1-shRNA细胞周期未出现明显停滞.免疫印迹的结果提示HCT116-PLKO.1细胞中P21基因被激活,但HCT116-LKB1-shRNA细胞P21的表达并未升高.结论 LKB1基因的沉默增强了HCT116细胞对AICAR的敏感性.可能是AICAR在HCT116细胞中通过LKB1-AMPK通路激活P21,导致细胞周期停滞,避免肿瘤细胞凋亡.
关键词： LKB1 AICAR HCT116大肠癌细胞 细胞凋亡 -
阿卡地新(AICAR)的LC-MS/MS检测方法的建立及应用
目的:建立阿卡地新(AICAR)的LC-MS/MS检测方法,在日常检测中使用.方法:取2ml尿样,加入50μl β-葡萄糖醛酸苷酶进行酶解,C18-SPE固相萃取,洗脱液氮气下吹干,后溶解上样.用此方法检测290名运动员内源性AICAR浓度,建立中国运动员AICAR内源性水平数据库.结果:方法验证中得出线性相关系数、低检测限和定量限,满足日常定性定量要求;药物日间精密度＜20％,日内精密度＜15％,回收率在85％以上;基质效应在80％～110％之间,符合一般验证要求;得到290名运动员内源性AICAR浓度平均值为1.5μg/ml,标准偏差为1.1μg/mnl.结论:本方法灵敏度高、选择性强、重现性好,可以在日常检测中使用.
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AMPK的激活调节COX-2对HT-29细胞增殖和凋亡的影响
目的:研究AMPK的激活在结肠癌HT-29细胞中对COX-2表达的影响, 并探讨其对细胞增殖和凋亡的作用.方法:用Western Blot方法检测AMPK的激活对COX-2表达的影响,MTT法检测不同浓度、时间的AMPK激活荆AICAR和选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用下的细胞存活率, 流式细胞术检测细胞凋亡率,用MTT法检测二者联合对细胞增殖的影响.结果:AMPK被激活后COX-2蛋白表达减少,随着AICAR和塞来昔布作用浓度、时间增加,细胞存活率呈剂量和时间依赖性下降,塞来昔布组和AICAR组凋亡细胞增多,早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞比例均高于对照组(P＜0.05),AICAR和塞采昔布联用后细胞的存活率为(23.0±0.82)%.均低于AICAR组(54.0±2.86)%和塞来昔布组(57.0±2.54)%.结论:AMPK激活可以抑制COX-2表达对人结肠癌HT-29细胞产生增殖抑制和凋亡诱导效应,AICAR和塞来昔布二者联用具有协同作用.
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体外研究腺苷酸活化蛋白激酶对食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过体外研究观察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活剂AICAR对人食管癌EC9706细胞的增殖及凋亡影响.方法 AICAR以不同浓度作用于人食管癌EC9706细胞,通过光学显微镜观察不同时间后EC9706细胞的生长状态,并用MTT方法检测其吸光度值及细胞存活率的变化,流式细胞术检测其细胞凋亡率情况.结果 随着AICAR浓度的增加,细胞的死亡数目明显增加.MTT法检测结果表明,AICAR能够抑制EC9706细胞增殖,并呈现出良好的浓度依赖性.流式细胞术检测结果显示,不同浓度的AICAR干预24 h后早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均高于对照组,但仅有总凋亡率有统计学意义(P＜0.01).结论 AMPK可以抑制人食管癌EC9706细胞的生长增殖,并可诱导EC9706细胞凋亡.
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AICAR对氯胺酮抗抑郁作用的影响
目的 观察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂AICAR对氯胺酮抗抑郁作用的影响,并探讨其作用机制.方法 健康成年雄性Wistar大鼠24只,随机均分为四组.大鼠强迫游泳15 min,建立急性抑郁大鼠模型.24 h后,四组大鼠腹腔分别注射等容量生理盐水(S组和K组)和AICAR 10 mg/kg(A组和AK组);30 min后腹腔再分别注射等容量生理盐水(S组和A组)和氯胺酮10 mg/kg(K组和AK组).给药完毕后30 min,大鼠强迫游泳6min,记录后5 min大鼠强迫游泳的不动时间.ELISA法检测大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)和活性调节细胞骨架蛋白(Arc)的表达.Western blot法检测大鼠海马雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达水平.结果 与S组比较,K组和AK组大鼠强迫游泳不动时间缩短,且AK组大鼠不动时间较K组缩短(P＜0.05).与S组比较,其他三组BDNF及Arc含量升高,且AK组含量高(P＜0.05),而A组和K组蛋白表达差异无统计学意义.与S组比较,K组和AK组p-mTOR的表达水平升高(P＜0.01),K组与AK组比较差异无统计学意义.mTOR四组差异无统计学意义.结论 大鼠腹腔给予氯胺酮可产生抗抑郁作用,且与大鼠海马组织BDNF、Arc及p-mTOR表达上调有关.大鼠腹腔预先给予AICAR能增强氯胺酮的抗抑郁作用,这可能与其能增加大鼠海马组织BDNF和Arc表达有关.
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AMPK激动剂AICAR抑制糖氧剥夺损伤后星形胶质细胞的炎性反应及对神经元损伤的保护作用
目的:探讨AMPK激动剂AICAR对糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤后原代星形胶质细胞炎性反应的影响及对损伤神经元的保护作用.方法:通过构建原代培养星形胶质细胞和神经元的OGD模型,在正常培养的原代星形胶质细胞中加入对照溶剂和AICAR(0.5 mmol/L),后给予OGD处理,在复氧第12 小时通过ELISA检测促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的表达变化,通过Western blotting方法检测磷酸化p38的蛋白表达;再将上述对照组和AICAR组OGD处理后的星形胶质细胞培养液,加入OGD损伤后的原代培养神经元中,通过LDH检测及免疫荧光双标方法,检测AICAR对缺糖缺氧损伤神经元的保护作用.结果:在原代培养神经元及星形胶质细胞OGD损伤模型中,与对照组比较,AICAR组显著地降低了OGD损伤后星形胶质细胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β(P<0.01),抑制p38磷酸化,且明显降低了缺糖缺氧造成的神经元损伤(P<0.01),促进损伤的神经突起修复.结论:AICAR抑制OGD损伤后星形胶质细胞炎性因子的释放,对OGD损伤神经元具有保护作用.
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小檗碱对HepG2胰岛素抵抗细胞模型中LKB1-AMPK-TORC2信号网络的影响
[目的]观察小檗碱对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型AMPK信号通路蛋白及其下游糖脂代谢关键蛋白表达的影响,探讨小檗碱改善胰岛素抵抗的分子机制.[方法]软脂酸诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型,予以不同浓度的小檗碱进行干预,同时以AICAR作为阳性对照,Compound C作为阴性对照,用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,甘油三酯试剂盒检测细胞内的甘油三酯含量,Western blot检测LKB1、AMPK、TORC2、PEPCK、G-6-P、P-ACC、ACC、FAS蛋白表达.[结果]软脂酸作用24 h使HepG2细胞葡萄糖消耗量显著下降,TG含量显著增加,LKB1、AMPK及P-ACC蛋白表达明显减少,TORC2、PEPCK、G-6-P、ACC、FAS蛋白表达明显增加;而小檗碱或AICAR则可逆转上述效应.[结论]小檗碱可以有效改善软脂酸诱导的胰岛素抵抗,其分子机制可能与小檗碱调控AMPK信号通路相关蛋白的表达有关.
关键词： 小檗碱 AICAR compound C HepG2细胞 胰岛素抵抗
