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Wilms瘤基因1低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立
目的 应用RNA干扰(RNAi)和RNA激活(RNAa)技术,分别构建小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA),建立Wilms瘤基因1(WT1)低表达和过表达的乳腺癌细胞模型.方法 以国外学者提供的3条序列(siRNA-516 、siRNA-803、siRNA-1029)构建WT1 siRNA干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1表达的序列(dsRNA-319)构建dsRNA过表达WT1,通过脂质体(LipofectamineTM2000)分别将siRNA和dsRNA转入MDA-MB-321和MCF-7细胞.WT1有效siRNA筛选实验分为6组:WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组；观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h.WT1 dsRNA的筛选实验分为3组:WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组；观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h.通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Westem Blotting筛选作用效果明显的siRNA和dsRNA.使用单因素方差分析进行统计学分析.结果 成功构建WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803和WT1 siRNA-1029共3个siRNA,并转染到MDA-MB-231细胞中,转染效率达90％以上.上述3个WT1 siRNA均能够抑制WT1 mRNA和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果为显著[WT1 siRNA-1029组WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著降低(0.49±0.02比1.00±0.08,P=0.00),其蛋白表达水平也明显降低].成功将WT1 dsRNA-319转染到MCF-7细胞中,转染效率达90％以上.50 μmol/L的WT1 dsRNA-319转染后96 h,MCF-7细胞的WT1过表达为显著[WT1 dsRNA-319组的WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著升高(319.06±14.84比1.00±0.07,P=0.00),其蛋白表达水平也明显升高].结论 成功建立低表达WT1的MDA-MB-231细胞和过表达WT1的MCF-7细胞模型,为后续进一步研究WT1在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础.
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Wilms瘤基因1表达与急性髓系白血病长期预后关系的Meta分析
目的 探讨Wilms瘤基因1(WT1)基因表达水平与急性髓系白血病(AML)长期预后的关系.方法 计算机检索PubMed、ScienceDirect、EBSCO、Web of Science、CNKI、VIP和万方数据库,收集符合纳入标准的研究,检索时限均为从建库至2015年3月,由两位研究者根据纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料并评价质量后,采用RevMan 5.2软件进行Meta分析.结果 共纳入11个研究,合计1 497例患者.Meta分析结果显示:WT1基因高表达是AML患者总生存率(OS)及无病生存率(DFS)的不利因素[HR=1.34,95％CI 1.14～ 1.58,P＜0.01;HR=1.35,95％CI 1.11～1.64,P=0.003];对于正常核型的AML患者,WT1基因高表达仍是OS的不利因素[HR=1.41,95％CI 1.01～1.99,P=0.05].结论 WT1基因表达水平是预测AML长期预后的有效指标.
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急性髓细胞白血病儿童Wilms瘤基因1及其剪接异构体的表达及临床意义
目的:探讨急性髓细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)患儿骨髓细胞中Wilms瘤基因1(Wilms tumor gene 1,WT1)及其剪接异构体WTI(17AA+)的表达及临床意义.方法:应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测112例次AML患儿不同阶段骨髓细胞中WT1和WT1(17AA+)mRNA的相对表达量,计算、WT1(17AA+)/WT1的比值,并以同期30例非白血病患儿作为对照.结果:AML初诊组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量均明显高于非白血病对照组及缓解期患儿(P<0.05).复发组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量与初诊组和耐药组相比,差异无统计学意义(P>0.05).缓解组患儿的WT1(17AA+)WT1比值明显低于初诊组、复发组和耐药组(P<0.05).3例AML患儿的动态监测结果显示,临床耐药或复发患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量以及WT1(17AA+)WT1比值均呈持续高表达,或者表现为一过性下降后的再度上升.结论:WT1及WT1(17AA+)mRNA剪接异构体可能成为判断AML预后及临床治疗疗效的指标.
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WT-1 mRNA定量分析在急性白血病移植后微小残留病监测中的意义
目的 探讨定量检测Wilms瘤基因1(WT-1)mRNA在急性白血病患者造血干细胞移植后的疗效、预后和预测复发中的价值.方法 收集84例经异基因造血干细胞移植的急性白血病患者不同治疗时间的骨髓标本,实时荧光定量聚合酶链反应技术(RQ-PCR)分析WT-1 mRNA表达水平;聚合酶链反应-短串联重复序列法(PCR-STR)分析移植后供体基因嵌合率,并进行统计学分析.结果 与AML和ALL治疗前组WT-1表达水平[分别为4.13(0.77,9.26)、0.69(0.16,2.35)]比较,AML和ALL治疗后组[分别为0.51(0.06,0.91) (U=164,P＜0.01);0.06(0.02,0.10)(U=315,P＜0.01]、缓解组[分别为0(0,0.06)(U=0,P＜0.01);0(0,0.03)(U=0,P＜0.01)]表达水平均明显下降.与缓解组相比,AML复发组[3.35(2.46,5.63)(U=0,P＜0.01)]、ALL复发组[2.46(2.17,3.31)(U=0,P＜0.01)] WT-1表达水平均明显上升.15例复发患者,在临床确诊复发前的WT-1水平明显升高.移植患者WT-1水平与供体基因嵌合率呈负相关(r=-0.73,P＜0.05).结论 WT-1mRNA定量分析可用于监测经造血干细胞移植急性白血病患者的微小残留病灶,评估疗效、预后及预测疾病复发风险.
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wt1定量联合FCM在急性髓细胞白血病MRD监测中的临床应用
目的 探讨在急性髓细胞白血病(AML)中Wilms瘤基因1(wt1) mRNA定量联合多参数流式细胞术(FCM)分析监测微小残留病灶的临床应用.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(qRT-PCR)检测35例AML患者的wt1表达水平;将患者根据不同亚型分组检测;并且对9例缓解和4例复发患者进行随访,检测wt1表达水平.采用FCM分析AML中微小残留病灶(MRD)水平.结果 与对照组比较,AML病例组wt1表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05).在初诊的各种AML亚型中,M2亚型wt1表达水平高,M6亚型wt1表达水平低.9 例随访患者提示在达到完全缓解时wt1表达水平下降,而4例随访复发患者在复发时再次升高.FCM检测MRD在不同阶段异常髓系细胞比例明显不同.联合qRT-PCR和FCM技术对MRD检测的敏感性和特异性大大提高,两者具有一致性;利用ROC曲线对复发病例进行分析得到的监测阈值为3.33%.结论 在急性髓细胞白血病中wt1 mRNA定量联合多参数流式细胞术分析可用于监测MRD、评估治疗效果、预后及预测疾病复发风险.
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定量PCR法监测白血病细胞微小残留病
目的：建立实时定量监测白血病细胞WT1基因表达的方法。方法：设计并合成WT1基因的全长引物，筛选引物和定量引物，构建HL60细胞的cDNA文库，从中调取并纯化WT1全长基因，通过Hind III与EcoR I的双酶切，连接构建到克隆载体pUC19中，通过菌落PCR，测序鉴定出阳性克隆pUC19- WT1。按有限稀释法制备标准品质粒pUC19- WT1，绘制WT1基因的扩增曲线，熔解曲线和标准曲线，建立全反式维甲酸诱导HL60细胞分化的模型，实时定量PCR法监测在ATRA处理HL60细胞后WT1基因的表达水平。结果：从HL60细胞的cDNA文库中扩增得到全长WT1基因，并构建到克隆载体pUC19中，菌落PCR筛选出阳性克隆pUC19- WT1，测序与预期相符合。WT1基因扩增的熔解曲线显示，Tm值为84，WT1的扩增，标准曲线显示，扩增效率为96%，R值为0.98。通过实时定量PCR监测ATRA诱导HL60细胞2天后，WT1基因表达水平显著下调。结论：成功建立了实时定量PCR监测白血病细胞中WT1基因表达的方法,为白血病以及微小残留病的临床监测奠定基础。
