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促自噬剂AZD8055对U87起始细胞Notch通路相关蛋白的表达和成球能力的影响
目的 研究促自噬剂AZD8055对U87细胞株起始细胞Notch通路相关蛋白的表达和成球能力的影响.方法 应用免疫磁珠法分选获得U87细胞株CD133阳性的胶质瘤起始细胞(GICs).采用免疫荧光染色技术鉴定GICs细胞球干性标志物CD133和Nestin,以及自噬相关蛋白LC3B和p62的表达.以CCK8检测AZD8055对U87起始细胞存活率的影响.采用Western blot检测AZD8055不同浓度处理组Notch 1、Notch胞内域、Hes1、p62、LC3B蛋白的表达.通过单细胞成球实验观察AZD8055对GICs成球能力的影响.结果 免疫荧光染色结果显示,GICs细胞球中CD133和Nestin呈阳性表达.CCK8检测结果提示,随着AZD8055浓度的增高,U87起始细胞的存活率逐渐降低.Westem blot结果提示,与溶媒对照组相比,随着AZD8055浓度的升高,药物处理组的自噬水平增高,而Notch1通路相关蛋白的表达降低,且各浓度组之间的蛋白表达差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫荧光染色结果提示,经AZD8055处理后U87起始细胞的LC3B表达明显升高,p62表达降低.单细胞成球实验显示,随着AZD8055药物浓度的增高,各组成球数目和细胞球体积递减,且差异有统计学意义(均P ＜0.05),说明U87 GICs的成球能力降低.结论 AZD8055通过诱发自噬抑制了Notch通路相关蛋白的表达,并且AZD8055能够抑制U87 GICs的成球能力.
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BMP受体在胶质母细胞瘤起始细胞早期分化中的表达
目的 在分离鉴定胶质母细胞瘤U87细胞中的胶质瘤起始细胞(GTICs)的基础上,检测在GTICs细胞中骨形态发生蛋白(BMP)受体1A、B的表达,探讨BMP受体1A、B对GTICs所起的生物学作用.方法 利用流式细胞术检测U87细胞中CD133和巢蛋白阳性细胞,细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测GTICs和普通细胞中BMP受体1A、B的表达.结果 CD133和巢蛋白阳性表达的细胞在瘤U87细胞中所占的比例分别0.92%和5.72%;GTICs可诱导分化为表达β-微导管蛋白和胶质纤维酸性蛋白的细胞;U87细胞的GTICs中BMP受体1A表达明显增高,而经诱导分化培养后的BMP受体1A的表达又明显降低,BMP受体1B表达变化不明显.结论 BMPs信号通路中BMP受体对调控GTICs的增殖分化可能起着重要作用.
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人原代胶质瘤起始细胞的生物学行为初步研究
目的 研究人原代胶质瘤起始细胞(GICs)的表型、自我更新能力、成瘤能力和耐药性等生物行为学特性.方法 运用常规培养法和条件培养法对来自手术切除的同一胶质母细胞瘤组织分别进行培养,同时获得贴壁生长的人原代胶质瘤细胞(AGCs)和GICs;通过免疫荧光染色法测定其神经胶质酸性蛋白(GFAP)、CD133和巢蛋白的表达,通过单克隆形成实验和梯度密度成瘤实验检测其成球和成瘤能力,利用细胞计数药盒-8检测两种细胞在嘧啶亚硝脲(ACNU)和长春新碱(VCR)作用下的增殖曲线.结果 GICs呈神经球样生长且表达CD133和巢蛋白;47.8%±5.6%的GICs 能够自我更新,而可表达GFAP的AGCs中仅有4.3%±1.6%能形成单克隆;ACNU对GICs的IC50=1×10-3.1 mol/L,对AGCs 的IC50=1×10-3.9 mol/L,两者相比较,相差显著(P<0.05);VCR对GICs的IC50=1×10-4.3 mol/L,对AGCs的IC50=1×10-5.5 mol/L,两者相比较,亦相差显著(P<0.05).结论 利用条件培养法可以获得具有明显干性的GICs,与分化的AGCs相比具有更强的自我更新能力和成瘤能力,且GICs对ACNU和VCR较AGCs更为耐药.
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Notch1通路对胶质瘤起始细胞侵袭迁移能力的影响及其机制研究
目的 研究Notch1通路对胶质瘤起始细胞(GICs)侵袭迁移能力的影响及调控机制.方法 (1)采用箱形图分析Bredel Brain、Sun Brain数据库中正常脑组织和胶质母细胞瘤组织Notch1mRNA的表达,采用Kaplan-Meier生存分析肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中胶质瘤患者的预后与Hes1表达的关系,采用热图分析GEO数据库中GICs、传统普通细胞系Notch1、CXCR4的表达.(2)采用免疫磁珠分选法建立U87 GICs和U251GICs系,免疫荧光染色检测细胞CXCR4、Notch1的表达.将U87 GICs和U251 GICs分为二甲基亚砜(DMSO)组、阴性对照无义序列(shNC)组、MK0752组、Notch1干扰序列(shNotch1)组,shNotch1组、shNC组细胞分别转染含shNotch1的重组慢病毒和对照序列,MK0752组、DMSO组细胞分别加入80 nmol/mL MK-0752和等量DMSO,Western blotting实验检测4组细胞Notch1、CXCR4、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白的表达.Transwell侵袭和迁移实验检测shNotch1组、shNC组细胞的侵袭和迁移能力. 结果 (1)箱形图显示胶质母细胞瘤组织Notch1 mRNA的表达高于正常脑组织,差异有统计学意义(P＜0.05).生存分析显示高表达Hes1的胶质瘤患者生存率明显短于低表达Hes1的胶质瘤患者,差异有统计学意义(P＜0.05).热图显示Notch1和CXCR4在GICs中表达高于传统普通细胞系.(2)免疫荧光染色检测显示Notch1和CXCR4在U87 GICs和U251 GICs中呈高表达并存在共定位关系.Western blotting检测显示MK0752组、shNotch1组U87 GICs和U251 GICs中Notch1、CXCR4、p-mTOR蛋白的表达低于DMSO组和shNC组.Transwell实验显示shNotch1组穿膜的平均每个视野细胞数低于shNC组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Notch1通路可以通过调控CXCR4的表达,促进GICs的侵袭迁移能力.
