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豚鼠鼻粘膜一氧化氮合酶表达
一氧化氮(nitric oxide, NO)是新近发现的一种具有多种而复杂生物学活性的小分子物质,是生物体内重要的信使分子和效应分子,参与体内众多的生理病理过程。NO具有松弛血管平滑肌、调节血液循环、抑制血小板聚集等作用,并被认为是一种重要的神经递质[1]。催化NO的生物合成酶称一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS),本检测旨在探索NOS在鼻粘膜上的分布及其生理学意义。 一、材料和方法 1.豚鼠12只,发育营养正常,雌雄不论,体重350 g左右(本校动物实验中心提供)。 2.制片:豚鼠灌注固定处死后,迅速取下双侧鼻甲粘膜,分别置入10%中性甲醛固定,1侧鼻粘膜6 h后移入15%蔗糖过夜,鼻粘膜包埋在OCT水溶性包埋剂中,做5 μm厚的冰冻切片;另1侧硅烷化载玻片行4 μm石蜡切片。 3.酶组织化学染色:冰冻切片过0.01 mol/L 的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)后,待其干燥,加入含有0.8 g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠(nicotinamide dinucleotide phosphate-Na4,NADPH-Na4, 美国Sigma公司)、0.6 g/L的硝基四氮醋蓝和0.3% Triton-X100的孵育液,置于37℃恒温箱内孵育1.5 h,显色后0.01 mol/L磷酸缓冲溶液冲洗3次,终止反应,常规酒精脱水、透明、封片。阴性对照:孵育液内不含NADPH-Na4。 4.内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)原位杂交检测步骤:采用eNOS原位杂交检测试剂盒(武汉博士德公司)。石蜡切片脱腊至水,蛋白酶K消化5 min,暴露mRNA核酸片段,cDNA双链探针变性后,每张切片加10 μL含地高辛标记探针的eNOS原位杂交液,湿盒中37℃杂交18 h,充分洗涤后,用免疫组化ABC法显示探针与鼻粘膜靶核酸形成的杂交体。阴性对照为省去滴加eNOS探针杂交液,其余方法和步骤不变。
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乙型肝炎病毒污染监测报告
1材料与方法用含有l%小牛血清磷酸缓冲溶液(0.0l mol/L,ph7.2)棉拭子对医疗器械表面反复涂抹10次,然后将采样棉拭子浸入1.5 mL磷酸盐缓冲溶液带回实验室.将样品置于4℃冰箱过夜,为提高检出率,浸出液经高速离心后,用酶联免疫法吸附试验(ELISA)法,检测HBsAg,结果判定P/N≥2.1为阳性.