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层粘连蛋白对体外培养颌下腺细胞影响的研究
目的:研究层粘连蛋白(laminin,LN)对鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSGCs)生长及分泌功能的影响.方法:取对数生长期的第2代大鼠颌下腺细胞用于实验,按加入不同浓度LN分4组(0、5.0、25.0和50.0 mg/L)进行培养,相差显微镜的观察,绘制生长曲线,MTT比色法、自动生化分析仪检测LN对细胞增殖及淀粉酶分泌功能的影响.结果:培养的RSGCs免疫组化鉴定CK8.13、S-100蛋白染色呈阳性,波形丝蛋白染色呈阴性.培养72 h后MTT法检测5.0-50.0 mg/L LN组细胞吸光度A值与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).培养96 h后检测培养液中淀粉酶的含量,各浓度组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:LN能促进RSGCs的黏附和增殖并保持RSGCs的正常分泌功能.
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单链DNA结合蛋白1沉默对颌下腺细胞放射后增殖修复的影响
目的 研究沉默大鼠颌下腺(submandibular gland,SMG)细胞单链DNA结合蛋白1(single-strand DNA-binding protein 1,SSB1)表达后,放射损伤下细胞的增殖及修复情况.方法 机械胰酶联合法进行大鼠SMG细胞原代培养及免疫组织化学法鉴定.实验分3组:正常细胞组、阴性对照组(Ad-HK组)和实验组(Ad-SSB1-shRNA组).重组腺病毒介导shRNA转染SMG细胞,荧光定量PCR检测SSB1表达沉默情况.CCK-8法及免疫荧光法分别检测细胞活性及γ-H2AX焦点数动态变化.结果 细胞免疫组织化学检测角蛋白和α-淀粉酶表达均呈阳性.转染72 h后转染效率接近90%,实验组SSB1 mRNA表达较正常细胞组明显降低(t=16.24,P<0.05).照射前,实验组细胞活性下降不明显,120 h时细胞活性才明显低于正常细胞组(t=3.29,P<0.05).5 Gy照射后,实验组各时间点细胞活性均明显低于阴性对照组和正常细胞组(F=10.19~30.13,P<0.05).γ-H2AX免疫荧光显示,沉默SSB1能抑制细胞DNA放射损伤修复.结论 沉默SSB1表达的大鼠SMG细胞对放射损伤更敏感.SSB1在大鼠SMG细胞DNA放射损伤修复中有着重要作用.
关键词： 单链DNA结合蛋白1 颌下腺细胞 电离辐射 DNA双链断裂 -
颌下腺细胞在不同生物材料上生长的比较研究
目的 研究体外培养条件下,颌下腺细胞在几种生物材料表面的生长及形态,为组织工程化人工涎腺构建提供依据.方法 分别将SD大鼠的颌下腺细胞接种在10mm×10mm的PGA (polyglicolic acid)、PLLA (Poly-(L)-lactic acid)及脱细胞处理后的SD大鼠气管材料表面进行体外培养,对细胞在不同材料上生长情况、形态进行观察.结果 体外培养条件下,生长在SD大鼠气管表面的细胞密度大于PGA及PLLA.扫描电镜下脱细胞气管上的颌下腺细胞见分泌颗粒.结论 SD大鼠脱细胞气管可用作组织工程化人工涎腺构建研究的生物材料.
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颌下腺细胞在不同孔隙率支架材料上相容性的研究
目的研究颌下腺细胞与支架材料体外复合培养中,支架材料的孔隙率对颌下腺细胞黏附、增殖及分化的影响.方法体外原代培养SD鼠颌下腺细胞,并传至第2代,将细胞浓度为50×106/ml的颌下腺细胞分别接种在孔隙率为76.3%、81.4%、90.6%、95.8%的胶原海绵支架上.于培养后1,3,5,7天取材,HE染色、扫描电镜观察及细胞计数检测等,评价何种孔隙率的胶原海绵支架适宜颌下腺细胞的增殖与分化.结果 SD鼠颌下腺细胞在孔隙率76.3%及81.4%的支架上增殖、分化较慢;在孔隙率为90.6%及95.8%的支架上生长良好,增殖较快,细胞周围分泌较多细胞外基质.结论颌下腺细胞在孔隙率为90%～95%的支架材料上,形成的细胞--支架复合物较佳.
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多聚赖氨酸对胎鼠颌下腺细胞培养的影响
目的:研究以多聚赖氨酸为生长底物对体外培养胎鼠颌下腺上皮细胞生长的影响.方法:以多聚赖氨酸包被培养板,对胎鼠颌下腺上皮细胞进行分离培养,应用相差显微镜及电镜观察细胞生长特性,免疫组织化学方法对细胞来源进行鉴定.结果:颌下腺细胞在包被有多聚赖氨酸的培养皿表面生长分化良好,呈单层生长;免疫组织化学检测单克隆角蛋白、上皮膜抗体呈阳性表达.结论:多聚赖氨酸在体外培养的过程中,可以促进细胞的黏附与生长.
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组织块法培养大鼠颌下腺细胞的实验研究
目的 探讨组织块法培养大鼠颌下腺细胞(RSGC)的方法与细胞生长的特点.方法 采用组织块法培养RSGC,使用酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,免疫组织化学SABC方法进行细胞角蛋白-8免疫组化染色,进行细胞来源鉴定.倒置显微镜下进行形态学观察,取第2代RSGC,FDA-PI双色荧光法检测细胞活力,MTT法绘制生长曲线.结果 细胞角蛋白-8染色阳性.倒置显微镜下,细胞主要呈3种形态,为圆形亮细胞、多角形暗细胞、梭形暗细胞.细胞活力＞95%,生长曲线表示细胞5 d开始进入对数生长期.结论 此方法简便,易操作,获得了大量的RSGC,为颌下腺细胞作为种子细胞的颌下腺组织工程研究提供了实验基础和理论依据.
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组织工程化颌下腺细胞与支架材料复合培养佳细胞浓度的实验研究
目的:研究颌下腺细胞与支架材料体外复合培养中,细胞接种浓度对复合培养物的影响.方法:体外原代培养SD鼠颌下腺细胞,并传代至第2代,细胞计数,按细胞浓度为10,20,30,40,50,60,70×106/ml接种于5 mm×5 mm×2 mm胶原海绵表面,并置于24孔培养板内,形成颌下腺细胞-胶原海绵复合物.继续培养,于接种细胞后1, 3, 5,7 d取材;HE染色、免疫组化、扫描电镜观察及细胞计数检测等,评价颌下腺细胞-胶原海绵复合物形成的佳细胞接种浓度.结果:50,60,70×106/ml细胞浓度的复合物中颌下腺细胞在支架材料上黏附、伸展及生长良好.10,20,30,40×106/ml细胞浓度的复合物中颌下腺细胞在支架材料上增殖分化及生长较差.细胞计数显示接种7 d时,各组材料细胞数均只有104/ml数量级,50,60,70×106/ml接种浓度时,细胞粘附数量是10,20,30,40×106/ml的2倍.结论:颌下腺细胞与胶原海绵复合培养佳接种细胞浓度为50×106/ml.与其它组织细胞复合培养的佳接种浓度相似.
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骨髓间充质干细胞在放射性涎腺损伤中的修复作用
目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠颌下腺细胞放射性损伤中的修复作用.方法 采用60钴照射,建立大鼠颌下腺细胞损伤模型,将BMSCs与颌下腺细胞共培养.激光共聚焦显微镜下观察细胞形态,采用MTS法检测细胞增殖情况.结果 60钴照射5 min可对体外培养的颌下腺细胞造成实验所需的放射性损伤.共培养细胞中部分BMSCs呈现颌下腺腺泡细胞形态,共培养细胞的增殖率高于经过放射性损伤的颌下腺细胞(P＜0.01),而与正常颌下腺细胞和BMSCs相比无统计学差异(P＞0.05).结论 BMSCs具有转化为颌下腺腺泡细胞的潜力,对放射性涎腺细胞损伤起到一定的修复作用.
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两种支架材料与颌下腺细胞体外复合培养的比较研究
目的将颌下腺细胞分别与颌下腺脱细胞基质(SGAM)生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,比较两种不同支架材料的生物相容性.方法用传代培养第2代的颌下腺细胞分别与SGAM生物衍生材料及胶原海绵体外复合培养,在一定时间通过扫描电镜观察细胞在不同支架材料上的生长情况.结果颌下腺细胞在SGAM生物衍生支架材料上,多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,数量较多,大小不等,形态各异,表面凸凹不平,突起丰富;表面结构似"银耳"状.而细胞在胶原海绵支架材料上大多附着在材料表面,数量较少,突起较少.结论颌下腺脱细胞基质支架材料与胶原海绵支架材料相比具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料.
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表皮生长因子对颌下腺细胞在胶原海绵黏附的影响
目的探讨表皮生长因子(EGF)对颌下腺细胞在胶原海绵支架上黏附的影响.方法体外原代培养SD鼠颌下腺细胞,并传至第2代,将其分别接种于含表皮生长因子修饰的胶原海绵上,和不含表皮生长因子修饰的胶原海绵上.于接种后7 d取材,进行细胞计数计算细胞贴附率;苏木素-伊红(HE)染色,扫描电镜观察等检测.结果实验组含有EGF,细胞贴附率为73.1%,对照组不含EGF,贴附率为62.8%(P＜0.05),HE染色及扫描电镜观察也证实:实验组的颌下腺细胞在胶原海绵支架上黏附,增殖及分化均优于对照组.结论 EGF对颌下腺细胞在胶原海绵上的黏附有促进作用.
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SD大鼠原代颌下腺细胞体外培养的生物学特征研究
目的:研究SD大鼠颌下腺细胞体外培养的生物学特征,为组织工程化涎腺样组织的体外构建提供有功能的种子细胞.方法:获取新生SD大鼠幼崽颌下腺组织,经酶消化后体外培养,倒置显微镜、电镜下行形态学及免疫细胞化学染色观察.绘制生长曲线,对涎腺细胞的生物特征进行评价.结果:体外培养的颌下腺细胞CK(anti-cytokeratin)及淀粉酶染色阳性,体外增殖活跃.结论:体外培养的颌下腺细胞增殖活跃,保持了腺细胞的生物特征,可作为体外构建组织工程化人工涎腺研究的种子细胞.
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TGF-β3对体外培养颌下腺细胞影响的研究
目的:研究转化生长因子β3(transforming growth factor β3,TGF-β3)对鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSGCs)的生长和分化的影响.方法:原代及传代培养RSGCs并观察TGF-β3对其增殖、分化和淀粉酶分泌功能的影响.结果:O.5 ng/ml～10.0 ng/ml TGF-β3明显促进颌下腺细胞的分化和分泌功能,对细胞的增殖无抑制作用.结论:TGF-β3能促进RSGCs的分化和淀粉酶的分泌功能,但对细胞的增殖无明显影响.
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表面修饰化材料对颌下腺种子细胞生长影响的研究
目的 探讨应用表面修饰技术处理的生物支架材料与颌下腺种子细胞复合培养研究对种子细胞支架材料上的附着、生长和分泌功能的影响.方法 选用明胶海绵36块,均分为3组.A组:明胶海绵材料与鼠颌下腺细胞复合培养物;B组:层黏连蛋白(laminin,LN)表面修饰的明胶海绵材料与鼠颌下腺细胞复合培养物;C组:转化生长因子(TGF-β3)表面修饰的明胶海绵材料与鼠颌下腺细胞复合培养物.各组在体外进行复合培养,3、7和15 d各时间点行组织学观察和扫描电镜观察,15 d行免疫组织化学鉴定细胞来源,测定上清淀粉酶含量并进行比较.结果 组织学和扫描电镜观察见培养第3天各组细胞分散于材料表面,无细胞突起形成;第7天见B组细胞数量明显多于A组和C组,细胞突起形成并锚定于胶原海绵表面;第15天,B组细胞数量仍多于A组和C组,并可见细胞之间有触突联系和腺管样结构形成.免疫组织化学染色观察复合培养的颌下腺细胞Brdu呈强阳性.随着接种后培养时间的延长,各组颌下腺细胞分泌的淀粉酶含量均有不同程度的增加.15d,C组淀粉酶含量明显高于A组和B组(P＜0.05).结论 应用细胞外基质和细胞因子成分对生物支架材料进行表面修饰,可促进颌下腺种子细胞在材料上的附着、增殖和分泌,有利于组织工程化颌下腺研究的进一步成功.
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表面修饰化明胶海绵支架与颌下腺种子细胞复合培养的研究
目的 应用表面修饰技术处理的明胶海绵与颌下腺种子细胞复合培养,研究表面修饰技术对颌下腺种子细胞在支架材料上附着、生长和分泌功能的影响.方法 选用明胶海绵36块,随机分A、B、C 3组,每组12块.分别用单纯明胶海绵、层粘连蛋白表面修饰的明胶海绵材料、转化生长因子β3表而修饰的明胶海绵材料与鼠颌下腺细胞在体外复合培养.培养后第3、7、15天行组织学观察、扫描电镜观察,第15天行免疫组织化学鉴定细胞来源,测定上清淀粉酶含量.结果 组织学和扫描电镜观察可见培养后第3天各组细胞分散于材料表面,无细胞突起形成;第7天B组细胞数量明显多于A组和C组,细胞突起形成并锚定于胶原海绵表面;第15天B组细胞数量仍多于A组和C组,并可见细胞之间有触突联系和腺管样结构形成.免疫组织化学染色观察复合培养的颌下腺细胞BrdU呈强阳性.随着接种后培养时间的延长,各组颌下腺细胞分泌的淀粉酶含量均有不同程度的增加.第15大C组淀粉酶含量明显高于A组和B组(p<0.05).结论 应用层粘连蛋白和转化生长因子β3对明胶海绵进行表面修饰,可促进颌下腺种子细胞在材料上的附着、增殖和分泌功能.
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SD大鼠颌下腺腺泡细胞培养及胶原海绵的细胞相容性
[目的]研究SD大鼠颌下腺腺泡细胞体外培养方法以及和胶原海绵的细胞相容性,探讨胶原海绵应用于涎腺组织工程支架材料的可行性.[方法]取新生SD大鼠颌下腺组织,胰酶消化后将细胞于适宜的体外环境培养、纯化、鉴定,并将鉴定好的颌下腺腺泡细胞移植到胶原海绵上,采用DAPI进行特异性的核染色,荧光显微镜下观察腺泡细胞与胶原海绵的相容情况,评价腺泡细胞与胶原海绵的相容性.[结果]体外培养的颌下腺腺泡细胞经纯化后能够分泌特异性的淀粉酶,免疫细胞化学淀粉酶抗体阳性染色,并能在胶原海绵上正常增殖.[结论]体外培养的颌下腺腺泡细胞具备腺泡细胞的生物学特征并与胶原海绵有很好的相容性,有望将胶原海绵作为组织工程化涎腺组织的支架材料之一.
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转化生长因子β3对鼠颌下腺细胞分泌功能的影响
目的研究转化生长因子β3(transforming growth factor β3,TGF-β3)对鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSGCs)分泌淀粉酶功能的影响. 方法原代及传代培养Wistar大鼠RSGCs,免疫组织化学鉴定细胞来源,按加入不同浓度TGF-β3(0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 ng/ml)分组,未加入TGF-β3的为对照组.采用噻唑蓝(MTT)比色法、自动生化分析仪和免疫印迹法检测24、48、72和96小时后TGF-β3对细胞增殖及淀粉酶分泌功能的影响. 结果培养的RSGCs 免疫组织化学鉴定CK 8.13、S-100蛋白染色呈阳性,波形丝蛋白染色呈阴性.MTT法检测各组细胞吸光度A值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05). 72和96小时后,0.5～10.0 ng/ml TGF-β3组与对照组比较,细胞分泌的淀粉酶明显增加,差异有统计学意义(P<0.01).免疫印迹法检测颌下腺组织及培养细胞的淀粉酶提取物形成蛋白表达一致的电泳带. 结论 TGF-β3能促进RSGCs的分化和淀粉酶的分泌功能,但对细胞的增殖无明显影响.
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原代培养大鼠颌下腺细胞分离方法的比较研究
目的探讨体外培养大鼠颌下腺细胞的分离方法并进行比较.方法取Wistar大鼠颌下腺分别采用直接分离法与胰酶消化法分离获取颌下腺细胞,并进行原代及传代培养;相差倒置显微镜观察细胞形态,苔盼蓝染色法测细胞成活率,MTT法检测培养细胞活性,并检测24、48、72和96小时不同时间培养上清液中淀粉酶的含量,免疫组织化学鉴定细胞来源及比例.结果直接分离法获取的细胞活性为70%,活力值为0.16±0.014,功能欠佳,经胰酶消化法所获取的细胞活性为85%,活力值为0.45±0.013,细胞形态完整、贴壁良好,且功能强;免疫组织化学检测颌下腺细胞α-SMA抗体、CK8.13抗体、keratin抗体呈阳性反应,胰酶消化法颌下腺细胞反应强度大于直接分离法.结论胰酶消化分离获取颌下腺细胞的方法优于直接分离法.
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组织工程颌下腺细胞与胶原海绵复合培养的实验研究
目的 研究大鼠颌下腺细胞在胶原海绵材料支架上的生长情况.方法 取8 d龄Wistar大鼠颌下腺细胞,传代培养至第2代细胞,按2×104/ml注射法接种于5 mm×5 mm×2 mm胶原海绵表面进行培养.术后1、2、3周行组织学观察、扫描电镜观察胶原海绵上接种颌下腺细胞形态结构特点;取复合培养3周的颌下腺细胞行免疫组织化学细胞角蛋白(cytokratin 8.13,CK8.13)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscular actin,α-SMA)染色,透射电镜观察细胞超微结构,鉴定细胞来源.分别取复合培养1 d,1、2、3周的培养上清,用Amano法测定淀粉酶含量,检测与胶原海绵复合培养的颌下腺细胞功能.结果 细胞接种后第1周细胞分散于材料表面,无细胞突起形成;第2周细胞数量有所增加、细胞突起形成并锚定于胶原海绵表面;第3周时附着的细胞数目增多,可见细胞表层有丝状纤维形成.免疫组织化学染色观察复合培养的颌下腺细胞上皮细胞特异性抗体CK8.13呈强阳性,肌上皮细胞特异性抗体a-SMA染色呈阳性.透射电镜下颌下腺上皮细胞表面可见微绒毛、胞浆皱褶和细胞顶部的酶原颗粒,胞核大卵圆形,胞质内见线粒体和粗面内质网.随着接种后培养时间的延长,与胶原海绵复合培养的颌下腺细胞分泌的淀粉酶含量有不同程度的增加.结论 胶原海绵具有良好的细胞相容性,颌下腺细胞与胶原海绵复合培养,细胞可保持增殖分化能力及分泌功能,有望成为颌下腺细胞的载体应用于组织工程支架材料.
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异丙肾上腺素对SD大鼠原代颌下腺细胞增殖的影响
目的:研究异丙肾上腺素对颌下腺细胞增殖的影响,为体外构建组织工程化涎腺提供充足的种子细胞.方法:采用不同的方式加入异丙肾上腺素后,用Brdu标记阳性的细胞比率及绘制生长曲线的方法,检测颌下腺细胞的增殖能力.结果:体外培养条件下,颌下腺细胞保持了对肾上腺素能受体刺激的反应,但与给药浓度及方式有关.结论:异丙肾上腺素能在一定作用时间和浓度条件下促进颌下腺细胞的增殖,能为体外构建组织工程化涎腺提供种子细胞.
