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新型血小板添加液对血小板低温液态保存效果的实验研究
目的 探讨使用改良的血小板添加液(PAS)替代70%自体血浆在低温液态条件下对血小板的保存效果.方法 采集6单位单采血小板,每一单位单采血小板平均分为3组,A组加入70%PAS-Ⅲ M/30%血浆10℃保存;B组加入100%血浆22℃保存;C组加入100%血浆和海藻糖-85℃保存.A、B组在第1、5、7、9天取样检测,C组在20 d后复苏取样检测.分别检测PLT计数、PDW、MPV、CD62p、HSR、PAgT、pH值、LDH以及GLU的变化.结果 保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和大聚集率降低;A组的LDH释放、GLU消耗、CD62p表达、HSR、血小板大聚集率与B组比较,差异有统计学意义(P<0.05).B组pH值在第5天起明显降低(P<0.05).C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少(P<0.05).C组PDW显著升高,除与B组第5天结果相似外,均高于A、B组各时间点结果(P<0.05).各组PLT计数相差不显著.结论 改良的PAS-ⅢM能够很好的替代血浆用于血小板的保存,同时在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果好于血浆常温保存.
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海藻糖在血小板保存中的应用
血小板制品因其常规保存时间短,不仅难以满足临床紧急输注需求,而且常大量过期报废.开发简便实用而安全高效的血小板保存技术,是当前输血医学的研究热点.海藻糖因其无毒副作用,负载技术简便易行,已经显露出在血小板冷藏保存、超低温冷冻保存以及冻干保存中的应用前景.本文就海藻糖的保护机制及其用于保存血小板的实验研究进展作一综述.
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血液细胞冷冻干燥保存的研究进展
血液细胞的冷冻干燥保存与传统的常温保存和低温保存相比,具有储存期限长、储存运输方便、输注安全等优点.本文从血液细胞冷冻干燥保存的细胞学基础,血小板、红细胞、脐带血冷冻干燥保存的现状,发展血液细胞冷冻干燥保存技术需要解决的关键问题等几个方面进行综述.
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海藻糖对红细胞保养液中 ATP酶活性的保护作用
国内外大量的研究表明,外源性海藻糖具有对生物大分子良好的非特异性保护功能.我们利用海藻糖的多元化合物特性对酶蛋白分子表面进行保护,研制出新型红细胞保养液,经实验证实海藻糖是1种良好的酶稳定剂,现报告如下.
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细胞内外海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响
目的 研究细胞内海藻糖对红细胞冻干保存后血红蛋白回收率及ATP水平影响.在一定条件下负载红细胞,细胞内海藻糖浓度保持恒定,研究细胞外不同浓度的海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响.方法 将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol的海藻糖溶液中孵育7h,制成海藻糖负载的浓缩红细胞,对照组为PBS负载浓缩红细胞,行冻干保存,测定Hb回收率及细胞内ATP水平.将PBS液、浓度为50 mmol、200 mmol、400 mmol的海藻糖溶液与海藻糖负载浓缩红细胞按1∶1比例混匀,行冻干保存及再水化,用氰化血红蛋白试剂盒测定Hb溶血率,计算Hb回收率.结果 经海藻糖负载的红细胞冻干保存,Hb回收率(44.46±5.15)％,细胞内ATP水平(1.91±0.33) μmol/gHb,对照组Hb回收率(7.71±2.71)％,细胞内ATP水平(0.88±0.25) μmol/gHb.2组相比较,P＜0 05,差异有统计学意义.细胞外PBS液组Hb回收率为(10.36±0.97)％,50 mmol海藻糖组,Hb回收率为(33.57±2.89)％,200 mmol海藻糖组,Hb回收率为(38.64±0.54)％,400 mmol海藻糖组,Hb回收率为(18.10±1.9)％.对照组PBS液组与50 mmol组、200 mmol组、40 0mmol组分别比较,差异有统计学意义.400 mmol组与200 mmol组、5 0 mmol组分别比较,差异有统计学意义(P＜0.01).200 mmol组与50 mmol组相比较,差异无统计学意义.结论 细胞内的海藻糖大大提高冻干红细胞Hb回收率且可保持冻干红细胞正常ATP水平.细胞外的海藻糖对红细胞冻干保存有保护作用,随着细胞外液中海藻糖浓度增加,冻干红细胞Hb回收率减少.
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改良血小板添加液低温(10℃)保存血小板的动物实验研究
目的 对添加海藻糖的血小板添加液替代70%血浆冷藏的血小板进行动物体内输注效果评价.方法 采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板,将浓缩血小板分3组保存.血浆常温组:添加100%血浆,22℃保存;添加液低温组:添加70%PAS-ⅢM/30%血浆,10℃保存;冰冻保存组:添加100%血浆,-85℃保存.以新鲜血小板为对照,常温血浆保存组在d 3,添加液低温保存组在d 3、7、9,冰冻保存组在d 20复苏后分别检测血小板缺乏兔模型的血小板24 h回收率和生存率.结果 除保存9 d的添加液低温组血小板存活率明显低于新鲜血小板存活率(P<0.05)外,血浆常温组、添加液低温组以及新鲜血小板的24 h回收率和存活率相互比较差异均无显著统计学意义(P>0.05).冰冻保存组血小板24 h回收率和存活率均低于其他各组(P<0.05).结论 改良的PAS-ⅢM能够替代血浆在低温条件下用于血小板的保存,能维持血小板的体内功能.
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冻干前人红细胞对海藻糖的负载影响因素研究
目的 研究影响海藻糖负载多种因素,探讨人红细胞对负载海藻糖的影响因素及规律性.方法 根据红细胞海藻糖的负载量衡量,利用硫酸-蒽酮法检测红细胞在不同胞外海藻糖浓度、不同孵育时间、不同孵育温度的条件下对海藻糖的摄取量,并检测红细胞溶血程度.结果 红细胞内海藻糖在负载液中的浓度<1 000 mmol/L、负载时间<9 h、负载温度<37℃条件下,海藻搪的摄取量呈正相关.在负载液中浓度为0、200、400、600、800、1 000mmol/L时.红细胞内海藻糖浓度分别为0、10.03、14.5、41.7、55.3和71.6 mmol/L;在温度为37℃时红细胞在浓度为l 000 mmol/L负载液中分别孵育0、1、3、5、7、9 h.胞内海藻糖浓度分别为0、5.73、6.11、55.7、和61.2 mmol/L.对温度、时间和胞外海藻糖浓度的统计分析显示,温度对负载后胞内海藻耱浓度的影响大(P<0.01).结论 37℃、采用新鲜红细胞在海藻搪浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育7 h能有效摄取海藻糖,使之达到对红细胞起到冻干保护作用的胞内海藻糖理论浓度.
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冻干血小板功能的体外评价
目的 评价冻干血小板的体外功能.方法 将经过可逆性激活抑制、添加DMSO和海藻糖等低温保护剂、冷冻干燥后获得的血小板再水化,与新鲜血小板比较,应用流武仪检测分析其CD62p和PAC-1的表达,评价血小板活化状态和血小板反应能力;应用APACT检测诱导剂诱导的血小板大聚集率并用SPAT评价血小板聚集和促凝血活性;应用扫描电镜和透射电镜技术研究血小板的形态和超微结构的变化.结果 经过血小板激活抑制剂和冻干保护剂预处理的冻干血小板,再水化后对凝血酶的大聚集率(79.0%)与对照组(86.2%)差异无统计学意义(P＞0.05),对ADP和没食子酸诱导的聚集反应比对照分别降低49.34%和26.25%;经凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%略低于对照组70.32%(P＜0.05),PAC-1再表达率为54.55%与对照组63.38%无明显差异;促凝血功能SPAT检测结果 69.4 s与对照组70.6 s差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经过冷冻干燥保护剂和血小板激活抑制剂预处理后获得的冻干血小板,体外聚集活性和促凝血功能接近新鲜血小板.
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海藻糖负载对人红细胞冷冻干燥保存影响的实验研究
目的 初步探讨红细胞冻干长期保存的有效方法 ,并比较冻干前海藻糖的负载与否对红细胞冻干保存效果的影响.方法 实验设实验组( 负载海藻糖冻干-复水后红细胞):37℃,红细胞负载海藻糖 7h 后,采用主要成分为含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和 150mmol/L 海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下冻干保存红细胞;对照组:未负载海藻糖冻干-复水后红细胞.冻干结束后用37℃的再水化液快速水化,检测 2 组的各项理化指标.结果 实验组红细胞冻千再水化后RBC 和 Hb 回收率要高于对照组(P＜0.05);ATP 酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢镁(G-6-PD)活性水平显著差异有统计学意义(P＜0.05)).结论 胞内海藻糖对红细胞冻干具有明显的保护作用,红细胞在 37℃孵育7h的条件负载海藻糖后冻干-复水后能保持细胞的理化稳定性.
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红细胞冻干保存前对海藻糖的负载
目的 探寻红细胞负载海藻糖的有效方法,评价负载海藻糖对红细胞各项理化指标的影响.方法 设实验组(负载海藻糖红细胞)和对照组(未负载海藻糖红细胞),使用硫酸-蒽酮法测定胞内海藻糖含量,检测负载后红细胞各项理化指标,通过流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性.结果 在37℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取随胞外海藻糖浓度的增加而增多,当海藻糖浓度为800mmol/L,水浴7h,红细胞负载海藻糖可达到有效浓度;且2组红细胞各项理化指标比较差异无统计学意义(P＞0.05);流式结果显示红细胞在高渗环境中负载海藻糖后,细胞膜结合很少量Annexin-V-FITC,并且破损细胞能被有效清除.结论 红细胞37℃孵育7h,胞外海藻糖浓度为800mmol/L,能有效摄取海藻糖,且保持红细胞的理化稳定性和膜结构完整性.
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二甲基亚砜在人红细胞冻干前负载海藻糖过程中的作用
目的 研究人红细胞冻干保存前负载海藻糖过程中二甲基亚砜(DMSO)的作用,优化红细胞负载缓冲液配方.方法 实验组以浓缩红细胞25份(10ml/份)负载海藻糖,负载缓冲液中添加DMSO;对照组25份负载海藻糖,负载缓冲液中未添加DMSO.37℃条件下孵育8h后,分别检测两组红细胞胞内海藻糖负载量、胞外游离血红蛋白水平、ATP含量、红细胞变形性,并利用流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性.结果 实验组与对照组红细胞的胞内海藻糖负载量分别为(57.033±4.883) mmol/L,(49.184±4.858)mmol/L(P＜0.05);胞外游离血红蛋白浓度分别为(4.131±0.473) g/L,(5.410±0.501 )g/L(P＜0.05);ATP浓度分别为(3.874±0.426)μmol/g Hb,(3.358±0.306)μmol/g Hb(P＜0.05);红细胞变形指数分别为0.330±0.0211,0.277±0.0232(P＜0.01);红细胞胞膜PS表达率分别为(5.04±0.495)%,(8.69±0.862)%(P＜0.01).结论 DMSO在红细胞负载海藻糖过程中可有效增加胞内海藻糖负载量,并显著改善负载缓冲液对红细胞胞膜的高渗损伤,更好地发挥海藻糖对红细胞的保护作用.
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DMSO在人血小板冻干前负载海藻糖过程中对血小板的保护作用
目的 研究人血小板冻干保存前负载海藻糖至细胞内过程中DMSO的作用,优化血小板负载缓冲液配方.方法 实验设对照组(负载缓冲液中未添加DMSO)和实验组(负载缓冲液中添加DMSO),使用流式细胞仪检测血小板负载海藻糖4h后膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达,通过激光共聚焦荧光显微镜观察血小板负载荧光物质LYCH 4h后其胞内LYCH的分布,同时检测实验组和对照组负载海藻糖4h后血小板平均体积(MPV).结果 两组结果比较,实验组CD62p、PAC-1的表达显著低于对照组(P＜0.05),实验组LYCH均匀分布在血小板胞质中,而对照组LYCH大部分分布在几个有限细胞器内,两组MPV未有显著性差别(P＞0.05).结论 DMSO在血小板负载海藻糖过程中可有效抑制血小板体外激活,并使胞质内海藻糖均匀分布,更好发挥海藻糖对细胞的保护作用.
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海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存中的效果比较
目的比较海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存过程中对细胞的保护效果.方法将浓缩红细胞、含有不同浓度海藻糖或蔗糖的30%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按照1∶3(V/V)的比例混合,-80℃冰箱中预冻1h,入冻干机内冻干处理后,用37℃等渗缓冲液快速水化洗涤样品,然后将其分为3个处理组:组1为30%PVP组(简称PVP组),组2、3为含有5%、10%和15%海藻糖或蔗糖的30%PVP组(简称海藻糖组或蔗糖组),测定各项指标.结果冻干红细胞再水化后,海藻糖组的细胞回收率[(18.86±4.63)%、(21.73±7.32)%和(18.01±4.53)%]显著低于PVP组[(45.97±11.77)%](P＜0.01);蔗糖组,蔗糖浓度为5%、10%时,细胞回收率分别为(37.40±2.90)%和(37.77±4.78)%,二者显著低于PVP组(P＜0.05),但当蔗糖浓度升至15%时,细胞回收率[(42.54±10.25)%]和PVP组无显著差异;血红蛋白回收率,海藻糖组[(50.00±3.47)%、(40.91±9.09)%和(52.09±7.01)%]显著低于PVP组[(77.27±3.63)%](P＜0.05),而蔗糖组和PVP组无显著差异,且显著高于海藻糖组(P＜0.05).洗涤后3组的游离血红蛋白浓度均＜1g/L,其余各项指标的对比关系类似于水化后指标.结论在冻干保护液中添加不同浓度的海藻糖或蔗糖对于提高冰冻干燥保存后红细胞的回收率和血红蛋白浓度作用不明显;但蔗糖可以提高冻干保存后红细胞的大变形指数且对红细胞冻干燥保存的效果要好于海藻糖.
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海藻糖、蔗糖、葡萄糖负载红细胞对冻干红细胞影响的比较
目的 探讨细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响.方法 以海藻糖、蔗糖、葡萄糖、PBS作负载液,将红细胞置各负载液中孵育37℃、7h,然后冻干红细胞.再水化后测定血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,评价海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响.结果 冻干后血红蛋白回收率:负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞明显高于PBS负载红细胞(P＜0.001),海藻糖与蔗糖负载明显优于葡萄糖负载(P＜0.001),海藻糖与蔗糖负载的红细胞无明显差异(P＞0.05).冻干后细胞内ATP含量:葡萄糖负载红细胞明显高于海藻糖及蔗糖负载红细胞(P＜0.001),负载海藻糖高于负载蔗糖(P＜0.05).可认为负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞冻干后,细胞内的ATP水平葡萄糖组高,海藻糖组其次,蔗糖组低.结论 细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞均有保护作用,综合血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,海藻糖较蔗糖及葡萄糖保护作用更好.
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海藻糖水替代机制对冻干红细胞保护作用的探讨
目的 探讨海藻糖对冻干红细胞复水回收率和残余水含量的影响及其对红细胞膜的保护机制.方法 将红细胞分别与100、200、400、600、800、1 000 mmol/L海藻糖负载溶液孵育,共6组,并设置对照组,用海藻糖检测试剂盒特异性检测红细胞中海藻糖加载量;用冷冻干燥机对红细胞做冷冻干燥,Karl-Fisher滴定法结合卡式炉法测定冻干红细胞中残余水含量;细胞计数仪检测复水后红细胞数目.结果 随着负载海藻糖溶液浓度的上升,冻干红细胞复水回收率先平稳后上升,当负载溶液浓度达到800 mmol/L时回收率高;残余水含量先保持不变,然后下降,当负载溶液浓度达到800和1 000 mmol/L时,残余水含量(％)3.47±0.21和2.43±0.18.此外,冻干红细胞组与冻干血影细胞组残余水相同.结论 初步证实了海藻糖通过水替代作用保护红细胞膜.
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人红细胞冻干保护剂的研究进展
冷冻干燥法是实现红细胞长期保存的方法之一,要实现冻干,首要解决的问题是维持细胞膜的完整性和功能.低温和干燥是对膜产生损伤的主要因素,通过添加保护剂,优化降温速率及冻干程序、复水方法等,可以缓解冻干过程对膜的损伤.其中冻干保护剂的作用是保持细胞膜结构和减少渗透性损伤,其构成主要为碳水化合物(糖类)、聚合物、蛋白类和其他一些成分.本文对目前常用的冻干保护剂的种类、作用机制、研究进展和存在的问题,进行了分析和总结,并对未来研究及发展方向进行了展望.
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常用细胞冻干保护剂的特性、作用机制及应用进展
细胞冷冻干燥保存是指把组织细胞、血细胞等在低温下冻结,然后在真空条件下升华干燥、除去冰晶,待升华结束后再进行解吸干燥,除去部分结合水的干燥方法.
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冻干血小板的制备及其应用的研究进展
研究血小板冻干保存的重要目的是实现血小板的常温下长期保存,可用于静脉输注,并能将其制备成生理性止血药和促创面愈合的药物,用于战争、自然灾害、突发事件和特别偏远地区伤病员的救治.国内外研究结果表明:血小板冻干是一个特别有价值的重要研究领域,研究制备出合格的冻干血小板有极大的可能性,但目前仍有许多问题没有得到很好的解决,仍需要政府和同道们进行高度重视和深入研究,造福于伤病员的健康.
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冷冻干燥保存兔血小板的实验研究
目的 研究冷冻干燥长期冻干保存的血小板制品的方法.方法 将24只大白兔随机分为3个实验组:在所抽取的兔血小板中添加血小板可逆性激活抑制剂、DMSO和海藻糖等低温保护剂,经过预处理、冷冻、一级干燥、二级干燥等过程冷冻干燥兔血小板,分别室温保存l d(实验1组)、7 d(实验2组)和15 d(实验3组)后经再水化;分别与各自冷冻干燥前的新鲜血小板为对照.并检测血小板回收率和聚集反应功能,并用851Cr示踪法评价血小板体内生存活性.结果 3个实验组血小板冷冻干燥后回收率分别为71.68%,68.760%和70.64%,组间无明显差异.实验1、2、3组对凝血酶的大聚集率(73.200%,77.53%和71.31%)与对照组(86.20%)差异无明显统计学意义(P＞0.05),对ADP和没食子酸诱导的聚集反应率(35.6%和58.0%、36.61%和62.56%,32.65%和60.12%)比对照组低(72.4%和91.0%);冻干后保存兔血小板的1、24和48 h体内生存率分别为70%-79%、52%-56%和32%-40%,3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 添加血小板可逆性激活抑制剂、海藻糖和DMSO后冷冻干燥获得的冻干兔血小板,具有较好的聚集活性和体内存活率,保存活性较为稳定.
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不同低温保护剂对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1表达影响的比较
目的 比较两种不同低温保护剂对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1(desmoglein 1,Dsgl)低温保存后表达的影响,为寻求皮肤组织低温保护剂的优良配方提供实验依据.方法 取烧伤患者整形术后自愿捐献所余大腿部刃厚皮片5块,于取皮后4 h内进行实验.根据冷冻时添加保存剂不同,将皮片分为3组.A组(n=2):0.5 mol/L的海藻糖/DMSO:B组(n=2):传统低温保护剂DMSO/丙二醇;置于-196℃液氮中分别储存7、21 d后复温取材进行实验;C组(n=1):新鲜刃厚皮片,不作任何保护剂处理.对各组皮片行免疫组织化学染色观察,RT-PCR方法检测皮片Dsgl基因水平.结果 免疫组织化学染色见储存7 d后,A、B组Dsg 1蛋白染色均呈棕黄色,分布较均匀,表皮基底细胞表达信号与C组相似;A、B组吸光度(A)值分别为0.285±0.006、0.284±0.004;与C组0.287±0.008比较差异无统计学意义(P＞0.05).储存21 d后,A组阳性细胞表达无明显减弱,B组强度减弱;A、B组A值分别为0.282±0.004、0.275±0.005,B组与A、C组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测示C组、储存7 dA、B组及储存21 dA、B组Dsg 1基因表达A值分别为0.814±0.012、0.810±0.012、0.803±0.008、0.806±0.008及0.782±0.013.储存后21 dB组和A、C组比较筹异有统计学意义(P＜0.05),余时间点组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 海藻糖与DMSO联合应用对皮肤组织Dsg1的保护作用优于DMSO/丙二醇.
