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Spink12文献资料
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小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化
目的 原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果.方法 提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞.融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定.用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12.结果 酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12.重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符.融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5 %.用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带.经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%.结论 成功表达并纯化了融合蛋白6×His-Spink12,为进一步研究Spink12的免疫避孕效果奠定了基础.
