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两种荧光标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果比较
目的 观察DIL和DAPI两种不同的标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果.方法 清洁级健康成年SD大鼠36只,随机分为实验组(DIL组,DAPI组)和对照组(DMSO组,PBS组).使用立体定位仪,向实验组大鼠侧脑室注入0.2％ DIL或10μg/ml DAPI各10μl,对照组大鼠侧脑室相应注入DMSO或PBS各10μl.注射后2h和24h对动物进行神经功能损伤评分(NSS).采用激光共聚焦显微镜观察注射后1、3、7d脑室及脊髓颈、胸、腰段室管膜细胞的荧光标记情况,对目标区域荧光强度进行半定量分析,并对不同组别和时间点的脑室及脊髓标本测定结果进行比较.结果 注射DIL及DAPI后2h,大鼠NSS评分很低,与相应对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),24h后基本恢复正常.DIL注射后1d,侧脑室及各节段的脊髓室管膜细胞胞质均显示红色荧光,一直持续到注射后7d.DAPI注射后1d,侧脑室内标记的细胞核形态清晰,呈蓝色,脑室脉络丛大量细胞亦可见蓝色荧光标记,但脊髓各节段室管膜区的细胞均未见蓝色荧光,注射后3、7d的情况与1d类似.两种试剂标记后,目标区域内各时间点的荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DIL可对内源性神经干细胞的细胞质进行标记,适合作为侧脑室和脊髓室管膜内源性神经干细胞的标记物.DAPI可标记细胞核,适合用于侧脑室内源性神经干细胞的标记.脑室注射荧光染料对动物影响小,是一项相对安全的操作.
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药源性红斑狼疮及其防治
药源性红斑狼疮(DILE)或称药源性狼疮(DIL)是指由于服用某些药物后出现类似于自发性系统性红斑狼疮(SLE)表现的一种综合征[1].目前国外有关药源性红斑狼疮的报道不断增加,而国内相关报道较少.
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荧光活性染料Dil标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化
背景:目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键.目的:观察经荧光活性染料Dil标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成.材料:SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供.Dil应用液为美国Molecular Probe Inc公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的Dil应用液5 μL,37℃下孵育25 min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化.另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化.主要观察指标:Dil标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力.结果:锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下Dil标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,Dil标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光.与未标记细胞比较,Dil标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化(P>0.05).成骨诱导7 d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变.结论:Dil能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,Dil标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力.
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脐带间充质干细胞促进烫伤创面愈合的作用机制
目的 探讨人脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem ceils,UCMSCs)多点局部注射后,修复烫伤皮肤创面的潜在机制.方法 机械消化法分离人UCMSCs,培养至第3代后,进行形态观察、免疫表型和多向分化潜能鉴定.将第3代UCMSCs与碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)共培养14d,免疫荧光法检测成纤维细胞标志物波形蛋白的表达;对比小鼠Ⅲ度烫伤模型多点局部注射UCMSCs后创面愈合率及创面愈合时间;Dil标记UCMSCs,局部注射后检测UCMSCs在创面局部的分布情况.结果 分离培养的UCMSCs的形态、表面抗原表达及体外诱导分化能力均符合间充质干细胞特性;经bFGF诱导后可显著提高UCMSCs中成纤维细胞标志物波形蛋白的表达量;局部注射UCMSCs可显著提高烫伤小鼠的创面愈合率,UCMSCs可定植于烫伤创面下.结论 UCMSCs具有较强的成纤维样细胞分化能力,经局部注射后,可通过定植于烫伤创面而显著提高创面愈合率.
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大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究
目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础.方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记.结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs.MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形.结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法.
