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类表皮生长因子域7基因shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的 用基因重组技术构建LV3-人类EGFL7基因的小发卡RNA(LV3-hEGFL7-shRNA)慢病毒表达载体.方法 设计靶向hEGFL7-shRNA序列,建立LV3-hEGFL7-shRNA,在慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+ Puro中放置hEGFL7-shRNA基因片段,DNA测序以及酶切的方式进行检测hEGFL7片段,转染293T细胞后对上清液进行浓缩,后在对病毒滴度进行检测.结果 EGFL7-shRNA核苷酸链有正确的插入顺序,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×108 TU·mL-1.结论 hEGFL7-shRNA慢病毒表达载体构建成功,鉴定可满足试验需求.
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AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定
目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体.应用 shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot 鉴定 AKT2基因在U87细胞中的下调作用.结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致.荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59x 10<'7>TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%.PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%.Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用.结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件.
关键词： 丝/苏氨酸蛋白激酶2 RNA干扰 短发夹结构RNA 慢病毒载体 -
靶向人EGFL7基因的短发夹结构RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响
目的 研究类表皮生长因子域7(EGFL7)基因特异性短发夹结构RNA(shRNA)对胶质母细胞瘤细胞系U251细胞体外增殖的影响。方法 在筛选出人EGFL7基因的有效RNA干扰靶序列并设计构建其重组慢病毒表达载体的基础上，感染胶质母细胞瘤细胞系U251细胞，荧光显微镜观察转染效率，实时荧光定量多聚酶链反应和蛋白质印迹分别检测EGFL7基因的mRNA和蛋白表达水平，甲基噻唑基四唑(MTT)法检测其增殖能力。结果 EGFL7基因的特异性shRNA转染U251细胞后，EGFL7的mRNA和蛋白表达水平明显降低；细胞的增殖受到明显抑制。结论 EGFL7基因的特异性shRNA可明显抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的增殖，提示EGFL7基因在胶质母细胞瘤细胞的增殖中发挥重要作用。
