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抑制JNK 磷酸化参与褪黑素对花萼海绵诱癌素引起的tau蛋白过度磷酸化的保护机制
目的：探讨花萼海绵诱癌素( CA)在成神经瘤细胞( N2a)引起tau蛋白过度磷酸化的机制,及褪黑素对其是否具有保护作用。方法小鼠成神经瘤细胞( N2a)给予CA 5 nmol·L－1处理,或同时给予褪黑素50 mol·L－1,或同时给予维生素E( Vit E)50 mol·L－1处理12 h,用免疫印迹技术检测tau蛋白在Ser422位点的磷酸化水平,磷酸化c-jun氨基端激酶( p-JNK)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶( p-MKK4)的含量,免疫荧光检测p-JNK含量和分布,荧光法测定细胞内丙二醛( MDA)含量,32 P-特异底物标记技术检测p38丝裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)活性。结果 CA在N2a细胞引起tau蛋白Ser422位点磷酸化水平显著升高(1.70±0.19,1.0, P<0.01),褪黑素拮抗CA引起的 tau蛋白Ser422位点过度磷酸化(0.98±0.12,1.70±0.19, P<0.01)；CA引起细胞内MDA含量升高(μmol·g－1蛋白,0.241±0.006,0.141±0.006, P<0.01),褪黑素和Vit E 均可抑制 CA 引起的细胞内 MDA 含量升高(μmol·g－1蛋白,0.172±0.004,0.193±0.005,0.241±0.006, P<0.01)；CA 不改变 p38MAPK 活性和蛋白水平,但引起 p-JNK 含量升高(1.91±0.27,1, P<0.01)和p-MKK4(1.81±0.09, P<0.01)含量升高,褪黑素抑制CA引起的p-JNK含量升高(1.11±0.15,1.91±0.27,P<0.01)和p-MKK4(1.14±0.06,1.81±0.09, P<0.01)含量升高；JNK抑制剂SP600125可抑制CA诱导的tau蛋白过度磷酸化,MKK4磷酸化抑制剂地昔帕明可消除CA诱导的JNK磷酸化和tau蛋白过度磷酸化。结论褪黑素抑制JNK磷酸化参与其对CA诱导的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化的预防作用。
关键词： 褪黑素 花萼海绵诱癌素 tau磷酸化 丝裂原活化蛋白激酶激酶4 -
基于不同钙释放机理的花萼海绵诱癌素A与去乙酰毛花苷的正性肌力作用研究
目的 与洋地黄类正性肌力代表药去乙酰毛花苷比较,研究蛋白磷酸酶(PP)抑制剂花萼海绵诱癌素A(Calyculin A)对心脏收缩力作用特点,分析Calyculin A正性肌力作用的钙释放机理.探讨能否以PP为靶点,开发正性肌力药物治疗心力衰竭.方法 分别用Calyculin A(1,4,10 nmol/L)和去乙酰毛花苷(0.1,1,10 μmol/L)对大鼠离体心脏灌流,分析大鼠心率(HR)、左心室舒张压(LVDP)和大上升速率(+dp/dtmax)的变化.采用Calyculin A(100 nmol/L)和去乙酰毛花苷(10μtmol/L)对大鼠左心室心肌细胞进行灌流,测定钙释放幅值、舒张期胞浆钙浓度(Ibaseline)及胞浆钙浓度恢复到静息状态值50％水平的时间(CTD50);分析Calyculin A(100 nmol/L)和去乙酰毛花苷(10 μmol/L)对咖啡因(20 mmol/L)诱导的大鼠心肌细胞钙释放的影响,分析肌浆网钙泵活性(SERCA2a)、钠-钙交换体(NCX)及肌膜钙泵(PMCA)综合活性的变化.结果 Calyculin A (1,4,10 nmol/L)与去乙酰毛花苷(0.1,1,10 μmol/L)均能显著增加离体大鼠LVDP和+dp/dtmax(P＜0.05),且减慢HR(P＜0.05),并呈现浓度依赖性.Calyculin A(100 nmol/L)与去乙酰毛花苷(10 μmol/L)均显著增加钙释放幅值(P＜0.05);Calyculin A还能显著降低Ibaseline(P＜0.05),显著缩短CTD50 (P＜0.05).Calyculin A(100 nmol/L)显著增加肌浆网SERCA2a的速率常数(P＜0.05);去乙酰毛花苷(10μmol/L)增加(NCX+ PMCA)的速率常数(P＜0.05),导致肌浆网SERCA2a在胞浆回吸收中所发挥作用的百分比下降(P＜0.05).结论 Calyculin A与去乙酰毛花苷对大鼠离体心脏作用没有显著区别,但Caly-culin A通过增强肌浆网SERCA2a的活性,增加钙释放幅值并降低Ibaseline实现其正性肌力作用.Calyculin A的作用靶点PP,可作为一个潜在靶点用于开发正性肌力药物.
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丙戊基褪黑素与褪黑素对花萼海绵诱癌素所致神经毒性的影响
目的 观察丙戊基褪黑素(melatonylvalpromide,Mtv)与褪黑素(melatonin,Mt)对花萼海绵诱癌素(calyculinA,CA)所致神经毒性的影响.方法 分别给予DMSO,5 nmol·L-1 CA,5 nmol·L-1 CA和50μmol·L-1 Mt,5 nmol·L-1 CA和50μmol·L-1 Mtv处理N2a细胞12h,倒置相差显微镜下观察细胞的形态,Hoechst33342染色后用荧光显微镜摄像观测细胞凋亡率,TBA法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,联苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,改良比色法测定过氧化氢酶(CAT)活性.结果 CA处理使N2a细胞突起显著变短变细,细胞凋亡率显著增加,细胞内MDA含量升高,SOD和CAT活性降低.Mt和Mtv均可减轻CA引起的细胞突起缩短和细胞凋亡,也能部分对抗CA引起的SOD和CAT活性抑制以及细胞内MDA含量升高,Mtv的作用强于Mt.结论 Mtv对CA所致神经毒性的保护作用强于Mt.
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褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导大鼠前脑脑片tau蛋白过度磷酸化的保护
目的用脑片研究花萼海绵诱癌素(CA)诱导骨架蛋白tau过度磷酸化,以及褪黑素(MT)的保护作用及可能机制.方法培养大鼠前脑脑片,分为5组:A组:正常对照组,B组: 0.1 μmol/L CA组,C组:10 μmol/L MT +0.1 μmol/L CA组,D组: 40 μmol/L MT +0.1 μmol/L CA组,E组:80 μmol/L MT +0.1 μmol/L CA组.用免疫印迹法检测tau的磷酸化程度,同时检测脑片组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果0.1 μmol/L CA使tau蛋白在Ser396/404、Ser198/199/202位点的磷酸化程度显著升高,脑片的MDA含量及SOD活性显著升高; MT能使tau蛋白在Ser396/404、Ser198/199/202位点的磷酸化水平显著降低;显著降低CA处理增高的脑片MDA水平,提高SOD活性.结论 CA能够诱导前脑脑片tau蛋白发生过度磷酸化;MT对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化具有保护作用.为深入探讨阿尔茨海默病发病机制和防治方法提供了实验依据.
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白藜芦醇对花萼海绵诱癌素所致小鼠空间记忆障碍的预防作用
目的:探讨腹腔注射白藜芦醇对昆明小鼠侧脑室注射花萼海绵诱癌素引起的空间记忆障是否有预防作用.方法:2月龄昆明小鼠44只随机分为4组,分别为生理盐水对照组、模型组、白藜芦醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组;生理盐水对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水,白藜芦醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组分别腹腔注射白藜芦醇5 mg/kg和10 mg/kg共21 d,除对照组外,第22天从侧脑室注射花萼海绵诱癌素4μL, 第27天进行Morris水迷宫定位航行训练,持续6 d,24 h后进行寻找平台潜伏期检测.再处死小鼠,进行灌流固定做高尔基染色观察神经元树突和树突棘,并取新鲜脑海马匀浆后检测SOD活性.结果:白藜芦醇低剂量组显著缩短侧脑室注射花萼海绵诱癌素引起的逃避潜伏期.白藜芦醇低剂量组显著增加侧脑室注射花萼海绵诱癌素引起的CA1区锥体神经元树突的长度和分枝数目.白藜芦醇低剂量组显著增加侧脑室注射花萼海绵诱癌素引起的海马CA1区锥体神经元树突棘的密度.白藜芦醇高剂量组显著增加花萼海绵诱癌素引起的海马SOD活性,而低剂量组并不改变SOD活性.结论:低剂量白藜芦醇对侧脑室注射花萼海绵诱癌素引起的空间记忆障碍具有预防作用,其机制可能与减轻花萼海绵诱癌素引起的树突损伤有关.
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褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响
目的 探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响及其机制.方法 采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2awt),给予CA处理,或同时给予50μmol/L Mel处理,用免疫荧光检测tau蛋白磷酸化水平,32P-特异底物标记技术检测GSK-3活性,免疫印迹技术检测P-Ser9-GSK-3β和GSK-3β的表达水平,计算P-Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比率.结果 ①CA可在N2awt细胞使tau蛋白在Ser396/404位点和Ser198/202位点过度磷酸化,同时伴有GSK-3活性升高和P-Ser9-GSK-3β表达水平降低.②Mel对CA引起的tau蛋白过度磷酸化有保护作用;Mel同时对抗CA诱导的GSK-3活性升高和P-Ser9-GSK-3β表达水平降低.结论 Mel可减轻CA引起的tau蛋白过度磷酸化,其机制可能与调节细胞内P-Ser9-GSK-3β的表达水平和改变GSK-3活性有关.
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褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制
目的探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制.方法采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2awt),给予CA处理,或同时给予不同浓度Mel或维生素E(Vit E)处理,并用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水平和蛋白磷酸酯酶2A(PP-2A)含量,32P-特异底物标记技术检测PP-2A活性.结果①CA可在N2awt细胞引起神经细丝过度磷酸化,同时伴有PP-2A含量和活性降低.②Mel对CA引起的神经细丝过度磷酸化有保护作用,且强于Vit E;Mel同时对抗CA诱导的PP-2A活性和含量降低.结论Mel可通过调节细胞内PP-2A的含量和活性而减轻CA引起的神经细丝过度磷酸化.
