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不同氧浓度对裸鼹鼠原代鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响
目的 建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养方法,观察不同氧浓度对裸鼹鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响,寻找适宜体外裸鼹鼠细胞增殖和生长的氧浓度.方法 利用机械法辅以化学法分离新生裸鼹鼠脑内胶质细胞,利用差速贴壁法进行星形胶质细胞纯化,通过设置3％、5％、10％以及20％等不同氧浓度环境,利用CCK8染色法分析不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞增殖速率,利用免疫细胞化学染色法观察不同氧浓度下裸鼹鼠细胞胞体伸长突起的状况从而进一步判断不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞生长状态.结果 利用机械及化学法分离裸鼹鼠胶质细胞并结合差速贴壁法能够成功建立体外裸鼹鼠星形胶质细胞模型.不同氧浓度环境下裸鼹鼠生长速率不同,随着氧浓度的升高,裸鼹鼠进入快速生长期所用的时间越短.氧浓度为20％时,裸鼹鼠星形胶质细胞较小,突起少,状态不佳,但是10％以下的氧浓度环境中,裸鼹鼠能保持较多的细胞突起,状态较好.结论 机械及化学法相结合,合并差速贴壁法能够成功建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养模型,10％氧浓度下既可以保证裸鼹鼠星形胶质细胞适宜的生长速率又能保证其处于良好的生长状态.
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实验动物在神经科学领域中的应用
实验动物学是生命科学和医学发展的重要基础.神经科学的各项研究也都是建立在动物实验的基础之上.近年来,随着实验动物资源的丰富和生物学特性的挖掘,越来越多的实验动物可供进行神经科学的研究.结合当前神经科学的研究前沿,我们选取了一些不同层次、各具特点的实验动物作一总结,为实验动物在神经科学领域的应用和推广前景进行分析与展望.
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小鼠多瘤病毒荧光PCR检测方法的建立及其在裸鼹鼠感染情况调查中的应用
目的 建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查.方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC 001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证.人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本.结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性.结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考.
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黄曲霉素对裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞基因表达的影响
目的:观察不同浓度黄曲霉素对裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞(AEC Ⅱ)相关因子mRNA表达的影响,探讨裸鼹鼠抵御肺癌的分子机制.方法:通过酶消化法分离裸鼹鼠肺组织细胞并用免疫黏附法进行纯化得到裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞进行原代培养,40小时后,实验组分别给予不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L)的黄曲霉素处理,溶剂对照组给予DMSO(0.4 mL/L)处理.黄曲霉素作用48小时后收集细胞,用实时定量PCR技术检测裸鼹鼠AECII细胞中的SP-C基因及TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等炎症因子的mRNA表达变化.结果:原代分离的裸鼹鼠AEC Ⅱ细胞纯度＞70％,活性＞90％,可用于体外实验.定量PCR结果显示黄曲霉素使裸鼹鼠AEC II细胞SP-C表达水平显著下降,TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等炎症因子的表达水平在黄曲霉低于2 mg/L浓度的条件下没有显著变化.结论:裸鼹鼠AECⅡ细胞在黄曲霉素导致细胞受损的情况下,仍然保持较低水平的炎症因子表达,这可能是其抵抗肺癌的机制之一.
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裸鼹鼠血清中免疫球蛋白的分离纯化及含量的检测
目的 利用Protein A亲和层析法分离纯化裸鼹鼠血清免疫球蛋白(Ig),并检测正常的裸鼹鼠血清中三种Ig(IgG、IgA、IgM)的含量.方法 采集裸鼹鼠外周血血清,用Protein A亲和层析法纯化血清Ig,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,测定其重链、轻链的分子量;利用ELISA试剂盒检测成年裸鼹鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量.结果 纯化后的裸鼹鼠血清Ig,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其重链和轻链的相对分子质量分别为55 000和25 000.雄性成年裸鼹鼠血清中IgG、IgA、IgM含量分别为;0.153±0.021 mg/mL、0.015±0.003 mg/mL和0.021±0.005 mg/mL;雌性分别为0.156±0.019 mg/mL、0.012±0.001 mg/mL和0.028±0.001 mg/mL.结论 运用Protein A亲和层析法成功分离纯化裸鼹鼠血清Ig,并测定了血清中三种Ig含量.
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裸鼹鼠与C57BL/6小鼠自噬调节的比较研究
目的 比较裸鼹鼠与小鼠的自噬调节,以期为裸鼹鼠高自噬、抗癌、衰老缓慢等生物学特性的研究提供参考.方法 利用电镜技术和蛋白印迹检测新生裸鼹鼠和C57BL/6小鼠肝脏和肺脏组织的自噬水平.自噬干扰裸鼹鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞,24、48、72h CCK-8细胞计数法检测细胞的增殖情况,蛋白印迹检测各组细胞各个时间点Beclin 1的表达水平.结果 与C57BL/6小鼠比较,裸鼹鼠组织的LC3B表达显著较高.裸鼹鼠细胞对自噬抑制剂3-MA具有一定的耐药性,自噬诱导剂雷帕霉素对裸鼹鼠细胞的增殖抑制显著高于小鼠细胞.结论 裸鼹鼠组织具有高自噬水平,应对外界的自噬抑制压力时,裸鼹鼠细胞的自身调节能力明显高于C57BL/6小鼠.
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裸鼹鼠的人工饲养繁育初步研究
目的 探索裸鼹鼠的人工饲养和繁育方法.方法 在科学的饲养管理和适宜的饲养环境下,采用全同胞兄妹交配的方法,观察统计裸鼹鼠的妊娠率、胎间隔、窝产仔数、离乳数和成活率.结果 通过7对裸鼹鼠的繁育观察,表明裸鼹鼠能适应人工环境.雌雄鼠初次交配年龄为8～12月龄,第1胎妊娠率为71.43％;5只母鼠第1胎平均产仔数9.20±3.90只/窝,离乳数7.60±5.03只/窝,成活率为75.10％±42.49％；第2胎胎间隔89.00±19.53 d、产仔数9.60±5.68只/窝、离乳数6.20±4.09只/窝,成活率为74.33％±34.19％;第3胎胎间隔99.60±17.17 d、产仔数12.40±4.77只/窝、离乳数10.00±3.08只/窝,成活率为82.91％±16.70％.结论 裸鼹鼠在人工环境适应后,繁殖性能大大提高,可以培育出实验动物化的裸鼹鼠.
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氯化钴诱导低氧对裸鼹鼠肝星形细胞增殖及凋亡的影响
目的 比较研究氯化钴(CoCl2)对裸鼹鼠及C57BL/6J小鼠肝星形细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用活细胞计数试剂盒(CCK8)法和流式细胞术分别检测不同浓度CoCl2对裸鼹鼠和小鼠肝星形细胞增殖活力以及和凋亡水平的影响.采用蛋白印迹测定CoCl2处理后裸鼹鼠肝星形细胞低氧诱导因子1α(HIF-1α)和凋亡相关蛋白(BCL2、BAX)的表达水平.结果 低浓度(50 μtmol/L)CoCl2对C57BL/6j、鼠肝星形细胞增殖活性具有明显的抑制作用,并能显著提高其凋亡率,然而同样剂量的CoCl2能够显著提高裸鼹鼠肝星形细胞的增值活性,对细胞凋亡率亦无明显影响.高剂量CoCl2(＞200 μtmol/L)虽能导致裸鼹鼠肝星形细胞增殖活力的降低,及凋亡率的升高,但裸鼹鼠肝星形细胞的变化幅度明显小于小鼠.同时CoCl2处理后,裸鼹鼠肝星形细胞HIF-1α的表达或累积显著升高(P＜0.05),BCL2/BAX比率显著上调(P＜0.05).结论 与C57BL/6J小鼠相比,裸鼹鼠肝星形细胞具有更强的抵抗CoCl2引起的化学性低氧损伤的能力.同时HIF-1α可能参与调控裸鼹鼠抵抗化学性低氧环境造成的损伤.
关键词： 氯化钴(CoCl2) 裸鼹鼠 肝星形细胞 凋亡 -
裸鼹鼠骨髓巨噬细胞分离培养方法的建立及其功能的初步研究
目的 建立一种裸鼹鼠骨髓巨噬细胞分离培养的方法,并通过与小鼠骨髓巨噬细胞进行比较研究其吞噬功能.方法 分离裸鼹鼠骨髓细胞,在含60 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)完全培养基的诱导下,体外贴壁培养6～7 d,采用倒置显微镜观察细胞的生长状态.裸鼹鼠骨髓细胞诱导结束后,采用流式细胞术检测贴壁细胞表面抗原CD11b和F4/80的阳性率,鉴定骨髓巨噬细胞的纯度;采用异硫氰酸荧光素(FITC)-dextran根据荧光强度比较裸鼹鼠和ICR小鼠骨髓巨噬细胞的吞噬功能.结果 通过本方法获得的贴壁细胞具有典型的巨噬细胞的形态特征,且细胞表面抗原CD1 1b和F4/80的阳性率均高于80％;裸鼹鼠与ICR小鼠骨髓巨噬细胞的吞噬率分别为99.87％士0.13％和88.79％±0.90％.结论 本文建立的方法是一种简单实用的体外分离培养裸鼹鼠骨髓巨噬细胞的方法,且能够获得高纯度、高活性的巨噬细胞.裸鼹鼠骨髓巨噬细胞的吞噬功能高于小鼠骨髓巨噬细胞.
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应用通用荧光引物筛选裸鼹鼠微卫星位点方法的建立
目的 建立使用通用荧光引物分步PCR法筛选裸鼹鼠微卫星位点的方法.方法 在特异性引物F链的5'端连接通用引物,先以特异引物R链和加长引物F链进行PCR,再加入通用荧光引物进行第二步PCR,后使用琼脂糖电泳和毛细管电泳检测扩增产物,同时以传统的荧光引物PCR为对照.结果 琼脂糖电泳结果显示,通用荧光引物PCR产生的目的片段清晰,引物特异性强,目的片段多态性与传统PCR产生的多态性一致,且片段大小均比传统PCR产生的目的片段大15 bp左右,与预期一致.毛细管电泳结果也显示,通用引物PCR结果检测的等位基因数与传统荧光引物PCR方法产生的数量完全一致,无杂带,扩增效率高,具有较强的可操作性.结论 使用通用荧光引物分步PCR法结果可应用于裸鼹鼠基因组大量微卫星位点的筛选.
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裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究
目的 探讨多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(PolyI∶C)诱导下裸鼹鼠肺脏、肠组织的病理变化以及低氧诱导因子(HIF-1 α)和坏死因子(NF-κB)信号通路关键基因的表达水平,分析裸鼹鼠抵抗病毒可能的分子机制.方法 裸鼹鼠分为PolyI∶C处理组、生理盐水对照组.注射12h后处死动物,肺脏和肠组织切片经HE染色后观察病理变化;提取裸鼹鼠肺脏、肠组织中mRNA,采用半定量RT-PCR方法检测基因HIF-1 α、VEGFb(血管内皮生长因子b)、VEGF c(血管内皮生长因子c)、FLT-1(血管内皮生长因子受体1)、Fiz1(血管内皮生长因子受体3结合锌指蛋白1)、NKRF(转录因子NRF蛋白)的表达水平.结果 与对照组相比,PolyI∶C处理组的肺脏和肠组织病理变化不明显,而所检测基因的表达水平几乎都显著下降,仅肠组织中的FIZ1的表达水平有所上升(P＞0.05).结论 PolyI∶C对裸鼹鼠没有产生明显的致病作用,它不能诱导裸鼹鼠体内HIF-1α和NF-κB信号通路活化,提示裸鼹鼠可能通过抑制相关信号通路的活性促使体内受感染的靶细胞迅速凋亡,从而清除入侵的病原体.
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抑癌基因p53在裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异
目的 比较裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠组织中抑癌基因p53表达的差异,并分析p53基因在不同年龄裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异.方法 采用Western blotting检测新生裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏中p53蛋白的表达,进一步比较了不同年龄裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肠道中p53蛋白的表达,同时采用RT-PCR检测了裸鼹鼠肝脏、肺脏中p53基因的转录水平.以及低氧处理裸鼹鼠皮肤成纤维细胞中p53基因的表达水平.结果 新生裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏组织中p53蛋白的表达低于新生C57BL/6J小鼠组织,成年裸鼹鼠肝脏、肺脏组织中p53蛋白表达量亦显著高于幼年裸鼹鼠.裸鼹鼠成纤维细胞在低氧条件下p53蛋白的表达量较高,并且随着低氧处理时间的延长,表达量进一步升高.结论 新生裸鼹鼠组织中抑癌基因p53表达水平显著低于C57BL/6J小鼠,并且p53基因随着年龄增长而发生变化.
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裸鼹鼠不同组织中低氧相关基因的表达
目的 检测幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中低氧相关基因的表达水平,分析裸鼹鼠耐低氧的分子机制.方法 分别提取幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中mRNA,采用RT-PCR方法检测低氧相关HIF-Iα、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF基因的表达.结果 成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中HIF-1α、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF的表达水平显著高于幼年裸鼹鼠.结论 裸鼹鼠体内低氧相关基因在不同年龄阶段表达水平不同.
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Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响
目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(Poly I∶C)对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调(P＜0.05),而C57BL/6小鼠则下调(P＜0.05).结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.
关键词： 裸鼹鼠 多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(Poly I∶C) 炎症 自噬 -
低氧对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞自噬水平及凋亡的影响
目的 比较裸鼹鼠成纤维细胞常氧与低氧条件下自噬与凋亡水平.方法 分别采用低氧(3％O2)与常氧(20％ O2)培养裸鼹鼠皮肤成纤维细胞,采用Western blotting、RT-PCR等方法检测自噬相关基因Beclin1、LC3的表达,并用流式细胞术检测低氧与常氧条件下裸鼹鼠成纤维细胞凋亡水平.结果 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞在低氧与常氧处理24 h时,LC3 Ⅱ蛋白的表达量并无明显差异,而低氧处理48 h后LC3 Ⅱ蛋白的表达量显著高于常氧组,并且裸鼹鼠成纤维细胞随着低氧培养时间的延长,LC3 Ⅱ蛋白表达升高.流式细胞术结果显现低氧处理组裸鼹鼠皮肤成纤维细胞凋亡率显著低于常氧组.结论 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞可以通过提高自噬水平适应低氧环境,这为今后深入研究裸鼹鼠耐低氧机制提供了参考.
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裸鼹鼠外周血白细胞免疫相关因子mRNA表达水平的检测
目的 检测生长期和成年期裸鼹鼠外周血白细胞免疫相关因子mRNA表达水平,以了解裸鼹鼠的正常免疫水平.方法 通过眼眶静脉丛采集6月龄和12月龄裸鼹鼠外周血,提取外周血白细胞mRNA,反转录成cDNA后,实时定量PCR检测各组裸鼹鼠外周血中白细胞IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TN F-α、IFN-γ的mRNA表达水平.结果 除了IFN-γ、IL-4各组间无显著差异,6月龄裸鼹鼠的IL-2、TNF-α显著高于12月龄裸鼹鼠,尤其是6月龄雄性裸鼹鼠的表达水平显著较高.而细胞因子IL-1,IL-6中,6月龄雄性裸鼹鼠的表达水平也显著高于12月龄裸鼹鼠.另外,对细胞因子IL-8、IL-12表达检测结果表明,12月龄雌性裸鼹鼠的IL-8表达水平低,而12月龄雄性裸鼹鼠的IL-12表达低.结论 生长期雄性裸鼹鼠的细胞免疫水平和体液免疫水平均高于同龄的雌性动物和成年动物.
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裸鼹鼠血液生理生化及尿常规值的测定
目的 对裸鼹鼠进行血液生理指标、生化指标和尿常规值测定.方法 采用全自动血细胞分析仪、生化测定仪及尿液分析仪对不同月龄、不同性别裸鼹鼠的血液学指标、生化指标值及尿常规值进行测定.结果 得到了3月龄、6月龄和9周龄以及不同性别裸鼹鼠血液生理生化值与尿常规值;部分血液生理指标受性别及月龄影响较大.结论 明确了裸鼹鼠部分血液生理生化及尿常规正常范围值,为今后裸鼹鼠研究奠定了基础.
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裸鼹鼠生化位点的初步研究
目的 研究裸鼹鼠(NMR)的生化位点特征,初步建立裸鼹鼠生化位点的检测方法.方法 以小鼠近交系的生化位点为参照,应用小鼠的检测方法,检测裸鼹鼠的11种同工酶的活性.结果 裸鼹鼠的酯酶-1、转铁蛋白为慢带;葡萄糖磷酸异构酶-1、苹果酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1为中间带;血红蛋白β链、肽酶-3、碱性磷酸酶-1、磷酸葡萄糖变位酶-1、酯酶-3、过氧化氢酶-2为快带.结论 7只裸鼹鼠的11个生化位点为一致的条带,无多态性,表现为纯合型.
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裸鼹鼠骨骼标本的制作及其形态学观察
目的 采用传统方法制备裸鼹鼠骨骼标本,对其骨骼系统进行形态学观察.方法 利用水煮法制作裸鼹鼠骨架,与C57BL/6J小鼠骨骼标本比较研究裸鼹鼠骨骼特点,并观察裸鼹鼠股骨三维结构.结果 所制作的裸鼹鼠骨架完整洁净,没有骨质损伤,裸鼹鼠头骨、椎骨、肋骨、四肢骨均具有适应于穴居习性的特征.结论 裸鼹鼠的骨骼具有典型的适应掘穴生活的特征.
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裸鼹鼠生长发育指标及主要脏器系数正常参考值测定
目的 测定不同周龄裸鼹鼠的生长发育指标及脏器系数正常参考值.方法 以本中心近3年来饲养繁殖的裸鼹鼠为数据来源,测量其生长发育指标及脏器系数.结果 裸鼹鼠生长发育过程中雌雄差异不明显.结论 裸鼹鼠生长发育各项指标及脏器系数参考范围的确定为其实验动物标准化及实验应用提供重要参考数据.
