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尿液细胞学检测方法在肾移植患者多瘤病毒BK感染中的临床应用
目的 探讨尿液细胞学检测方法在肾移植患者多瘤病毒(BKV)感染筛查和监测中的价值.方法 收集2006年1月至2008年12月期间129名肾移植患者的尿液标本,镜检查找诱饵细胞(decoy细胞).再利用聚合酶链反应(PCR)检测Decoy细胞阳性患者(病毒尿症)预留的血液标本中相应的核酸并随访.血肌酐升高及持续性病毒血症、病毒尿症者进行移植肾穿刺活检术,对检测结果进行分析评价.结果 25名患者(19.4％,25/129)的439份尿液标本检查到decoy细胞,首次检测到decoy细胞的中位时间为移植后69(14～540)天；8名患者(6.2％)存在病毒血症,早出现在移植后119(56 ～540)天.3名患者(2.3％)病理证实存在BK病毒肾病(BKVAN),全部来自持续性decoy细胞(+)组且存在病毒血症.早检测到decoy细胞时间比病毒血症和病理诊断分别提前52和81天.Decoy细胞检测预警BKVAN的敏感度为100％,特异性82.5％,阳性预测值12.0％,阴性预测值100％.结论 尿液细胞学中的Decoy细胞镜检方法是一项简单而且敏感的筛查BK感染的方法,和病毒血症相比能更早的提示BK病毒感染.
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多瘤病毒样颗粒的制备及血清学检测方法的建立
目的 制备多瘤病毒(John Cunningham virus,JCV)病毒样颗粒并建立JCV血清学检测方法,了解我国一般人群JCV流行情况.方法 通过基因合成技术合成JCV衣壳蛋白基因VP1,将其克隆至PET-21a质粒,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,IPTG诱导表达,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定目的蛋白表达.采用2次超速离心法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE、透射电子显微镜及血凝试验鉴定纯化产物.以纯化产物为抗原建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法,筛查一般人群血清标本,分析该人群JCV感染情况.结果 通过透射电子显微镜观察及血凝试验鉴定,显示纯化产物具有和天然JCV颗粒类似的形态结构和血凝活性.以纯化的JCV病毒样颗粒为抗原建立了间接ELISA法,筛查了一般人群抗JCV IgG抗体,结果显示一般人群抗JCV IgG抗体阳性率为54.2％.结论 本研究制备了JCV病毒样颗粒,所建立的ELISA法可应用于JCV人群血清流行病学调查.
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多瘤病毒感染与妇科肿瘤相关性的初步研究
人多瘤病毒(John Cunningham Virus,JCV)是广泛存在于人体内的一种多瘤病毒,近二十年,国外研究显示JCV感染与多种神经系统及消化系统肿瘤高度相关,而JCV感染与妇科肿瘤关系的研究还鲜有报道.本研究在建立JCV核酸检测方法及规程的基础上,收集子宫肌瘤(98例)、子宫颈癌(84例)、子宫内膜癌(40例)、卵巢肿瘤(72例)患者临床资料、活检组织及血和尿样.运用PCR技术对上述患者活检样本及血、尿样本实施人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒Ⅱ型、人类疱疹病毒(Estein-barr virus,EBV)、巨细胞病毒和多瘤病毒JCV及BKV(B.K.virus,BKV)核酸检测.子宫颈癌高度相关人乳头瘤病毒在子宫颈癌组中检出率(19.0％)明显高于其它组,单纯疱疹病毒Ⅱ型、EBV及巨细胞病毒检出率几乎为0.BKV在尿样中的检出率明显高于血样及活检组织检出率,且检出率在各患者组中无显著差异.JCV检出率在血清样本及活检中几乎为o,然而,尿样中检测率均超过50％,且在子宫肌瘤患者组中高达65.3％.本研究显示JCV感染与子宫肌瘤高度相关,为子宫肌瘤的发病机理提供了新的病原学参考证据.
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同时检测人多瘤病毒和巨细胞病毒PCR技术的建立及在肾移植受者中的初步应用
建立同时检测人多瘤病毒(BKV)和巨细胞病毒(CMV)载量的实时定量荧光PCR技术(FQ-PCR),并探讨其在肾移植术后感染监测中的应用.选择BKV和CMV核酸保守性序列作为靶基因,PCR扩增靶片段与质粒pcD-NA3.1(一)连接.通过测序技术对进行克隆筛选.提取质粒并采用10倍梯度稀释(5×103～107拷贝/mL)作为BKV和CMV核酸序列的标准品,并评价其灵敏度；采用对比正常人DNA、BKV阳性质控和CMV阳性质控评价其特异性；通过对标准品DNA分别进行批内和批间各20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度.对480例肾移植受者外周血样本,进行FQ-PCR检测BKV和CMV DNA拷贝数,检测FK506血药浓度,并对两者进行相关性分析.重组质粒经测序检测显示含有靶BKV和CMV核酸序列.所建立的FQ-PCR方法,其低检测下限均为5.0×103拷贝/mL的DNA标准品.正常人DNA的BKV和CMV拷贝数检测为阴性,而阳性对照能够发现荧光值显著变化,证实为针对靶DNA的特异性扩增；重复性检测显示批内差异分别为3.44％(BKV)和2.23％ (CMV),批间差异分别为4.98％ (BKV)和3.76％ (CMV).肾移植患者CMV感染的阳性率为27.08％(130/480),明显高于BKV的阳性率(13.33％,64/480,P＜0.05),并且感染程度与免疫抑制剂FK506用量呈正相关.建立的同时检测BKV和CMV两种病毒载量的FQ-PCR方法具有快速、重复性好、灵敏的优点,可为临床监测肾移植术后病毒感染提供技术平台.
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恶性间皮瘤可能与致瘤性猿猴病毒SV40无关
目的 探讨致瘤性猿猴病毒SV40(simian virus 40)是否与中国人恶性间皮瘤的发生相关.方法 从蜡块中提取17例恶性间皮瘤组织中的DNA后,用三组引物对SV4O大T抗原(TAg)的基因片段分别进行聚合酶链反应(PCR)扩增,另外,用两种SV40相关抗体(Pab101和Ab-2)分别进行免疫组织化学染色,检测肿瘤组织中是否存在SV40 TAg.结果 (1)一组引物的PCR反应仅有3例扩增出了SV40 TAg的基因片段,其余两组引物的PCR反应均为阴性.(2)两种抗体的免疫组织化学染色均未检测出SV40 TAg.结论 中国人恶性间皮瘤与SV40感染的关系可能不密切.
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新近发现的细小病毒与多瘤病毒感染
2005年以来,研究人员又相继发现了新的与人类疾病相关的DNA病毒,包括属于细小病毒科的人博卡病毒(human bocavirus,HBoV,2005年[1])、人细小病毒4(human parvovirus 4,PARV4,2005年[2])与人细小病毒5(human parvovirus 5,PARV5,2006年[3]);属于多瘤病毒科的KI多瘤病毒(KI polyomavirus,KIPyV,2007年[4])、WU多瘤病毒(WU polyomavirus,WUPyV,2007年[5 ])及MC多瘤病毒(MCPolyomavirus,MCPyV,2008年[6])等.目前对于新近发现的这些DNA病毒的研究包括基因结构特征、流行病学、感染后临床特征、检测方法等各个方面.尽管分子生物学技术方法的发展与应用,实现了对病毒更敏感、特异、快速与深入的研究,但大部分新近发现的病毒与人类疾病的相关性仍不十分清楚[7].本综述就新近发现的DNA病毒:人博卡病毒、人细小病毒4、人细小病毒5、KI多瘤病毒、WU多瘤病毒、及MC多瘤病毒的发现、分子检测方法及其各自的病原学意义作一简要综述.
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JC 病毒检测方法研究进展及对比
JC 病毒（John Cunningham virus，JCV）属于乳多空病毒科（Papovaviridae）多瘤病毒属（Orthopolyomavirus），1971年从进行性多灶性白质脑病（ progressive multifocal leukoencephalopathy， PML）患者的脑中分离并以该患者名字命名，普通人群血清阳性检测率为40%~60%，因 AIDS 并发PML 的患者致死率约为50%，对于免疫力缺陷和免疫力低下的既往感染者，还会引起多瘤病毒相关性肾病（polyomavirus-associated nephropathy，PVAN）、病毒血症等相关疾病，并与胃癌、肺癌、食管癌等癌症的发生密切相关，但其致病机理尚未阐明。由于目前无特异的预防和治疗方法，因此在病毒感染早期的准确检测对疾病的诊断和治疗十分关键，尤其在免疫低下的人群中实现高效、精准、及时的检测至关重要。本文对现有 JC 病毒的检测技术进行了分析与总结，一些新兴技术的涌现将为实现临床上快速、高效的检测提供参考。
关键词： JC病毒 进行性多灶性白质脑病 多瘤病毒 肾病 病毒检测方法 -
肾移植前后行尿液和外周血监测多瘤病毒的护理干预
目的 为肾移植提供第一手临床资料,预防或减少肾移植术后多瘤病毒BK(BKV)相关性肾病的发生,提高移植肾的长期存活.方法 对终末期肾病血液透析患者的尿标本采用聚合酶链反应(PCR)结合测序方法检测尿中BKV DNA;对血标本采用DNA核酸分析仪进行检测.结果 在血液透析患者尿液及外周血BK(BKV)检测中,尿液检测的阳性率占24.21%,血液标本阳性率占34.2%.结论 在肾移植前,对终末期肾病血透患者进行常规尿液及外周血进行BK(BKV)的检测,为肾移植术后并发多瘤病毒相关性肾病,提供理论依据是可行的.
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广东地区首例WU多瘤病毒的检出与鉴定
WU多瘤病毒(WU Polyomavirus,WUPyv)是新近发现的与人类疾病相关的多瘤病毒,由美国和澳大利亚学者Gaynor等于2007年从小而下呼吸道感染分泌物中发现,属于多瘤病毒.在发现该病毒不到2年的时间里,世界上已经有美国、韩国、加拿大等十几个国家报道从呼吸道感染患者标本中检出WUPyv.我国浙江、北京学者也相继有报道从急性呼吸道感染婴幼儿标本中检测出该病毒,但华南地区至今未见报道.我们在广东地区首次检出WUPyv并进行了分子生物学鉴定,现报告如下……
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BK病毒在干细胞移植术后出血性膀胱炎中的作用研究
目的 探讨BK病毒在造血干细胞移植术(HSCT)后出血性膀胱炎(HC)中的致病作用,分析BK病毒尿及Hc的相关危险因素.方法 收集2006年8月至2007年11月间80例HSCT患者的血、尿标本,用PCR方法检测BK病毒DNA,同时用免疫荧光组化法检测血巨细胞病毒(CMV)抗原,20例健康成人为正常对照.结果 80例HSCT患者中15例发生HC(发病率18.8%),中位发生时间为移植后44(13～150)d,持续时间11(2～25)d.80例患者中尿检出BK病毒30例(检出率37.5%),其中13例为HC患者(占HC组86.7%).HC患者尿BK病毒中位检出时间为移植后23(0～56)d,早于HC发生时间.尿BK病毒持续阳性中位时间为7(2～14)周,长于HC持续时间.80例HSCT患者中12例检出CMV抗原血症,尿BK病毒阳性组检出率为36.7%(11/30),HC患者检出率为40.0%(6/15).30例尿BK病毒阳性患者中9例发生Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)(30.0%).有2例HC患者及20例正常对照者未检出BK病毒尿.所有血标本BK病毒检测均阴性.单因素分析显示CMV抗原血症、Ⅱ～Ⅳ度aGVHD是BK病毒尿的危险因素.结论 BK病毒尿是HSCT术后迟发性HC的主要发病原因,CMV感染与aGVHD可能诱发BK病毒相关性HC的发生.
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移植肾患者的多瘤病毒感染
肾移植受者的多瘤病毒感染越来越受到人们的重视.本文主要综述肾移植术后多瘤病毒感染的表现、诊断及防治.
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肾移植术后尿中多瘤病毒BK的检测及意义
目的探讨尿中多瘤病毒BK(BKV)检测在肾移植后BKV感染中的诊断价值.方法采用聚合酶链反应(PCR)结合测序方法检测61例肾移植后患者尿中BKV DNA,并与30例血液透析患者和30例健康志愿者尿液检测结果对照.结果肾移植组BKV DNA检出率为36.1%(22/61),明显高于血液透析组的13.3%(4/30)(P＜0.05),对照组检测均为阴性(P＜0.05).1例BKV阳性肾移植患者出现输尿管梗阻.移植组发生排斥反应和未发生排斥反应患者的BKV DNA检出率分别为40.9%(9/22)和33.3%(13/39),P＞0.05;肾功能正常和异常者BKV DNA的检出率分别为36.0%(18/50)和36.4%(4/11),P＞0.05.结论肾移植患者是引起BKV尿的高危人群.肾移植后有无排斥反应史及肾功能正常与否与BKV尿无相关性.尿BKV检测可作为肾移植后BKV相关性输尿管梗阻的鉴别诊断和多瘤病毒相关性肾病的筛选方法.
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单中心101例多瘤病毒肾病的临床病理特点
目的 总结肾移植术后多瘤病毒肾病(PyVN)的临床病理特点及预后.方法 回顾性分析2006年1月至2016年10月本中心101例PyVN患者的临床资料,以及病毒学和病理学检测结果.男72例,女29例.101例确诊PyVN时距离手术时间为16.5个月(2.2 ～63.9个月),其中术后2年内86例(85.1％).移植肾穿刺原因包括血肌酐较基础值升高81例(80.2％),血肌酐升高伴蛋白尿13例(12.9％),筛查发现BK病毒感染5例(5.0％),单纯蛋白尿2例(2.0％).结果 101例确诊PyVN时,98例(97.0％)尿BK病毒-DNA阳性,病毒载量为1.5×109拷贝/ml(0 ～9.0×1011拷贝/ml),80例(79.2％)血BK病毒-DNA阳性,病毒载量为1.8×104拷贝/ml (0～2.1×107拷贝/ml).确诊时5例患者移植肾失功,96例带功患者的中位血肌酐为187.0 μmol/L.中位随访20.1个月(3.7 ～109.6个月),新增失功患者19例(18.8％).其余77例带功患者的中位血肌酐为165.0 μmol/L,与确诊时带功患者血肌酐相比差异无统计学意义(P＞0.05).101例PyVN患者中A期18例,B期72例,C期11例.用Kaplan-Meier法计算A期、B期和C期患者术后5年移植肾存活率分别为92.9％、82.8％和55.6％.结论 PyVN可发生在肾移植术后5年内,尤其以术后2年内多见,临床表现以血肌酐升高、BKV血症和BKV尿症为主.移植肾组织病理损伤程度越重,临床预后越差.
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移植患者免疫抑制剂治疗后感染多瘤病毒及巨细胞病毒的现状
目的 探讨移植患者在接受免疫抑制剂他克莫司(FK506)治疗后感染多瘤病毒(BKV)与巨细胞病毒(CMV)情况,为器官移植研究提供流行病学依据.方法 采用FQ-PCR检测605例肝、肾、骨髓移植患者BKV和CMV的感染载量,ELISA检测患者FK506的血药浓度,并对结果进行统计分析.结果 605份标本中,共检测BKV感染者79例,感染率为13.06％,CMV感染148例,感染率为24.46％,双重病毒感染者为35例,感染率为5.79％;肝移植患者感染BKV和CMV阳性率为12.61％和15.97％,肾移植则分别为13.33％和27.08％,而6例骨髓移植标本则未发现病毒感染;CMV感染阳性率明显高于BKV,而病毒感染阳性者,则其FK506血药浓度较高(P＜0.05).结论 移植患者在使用免疫抑制剂FK506后易感染BKV和CMV,并且感染程度与FK506血药浓度相关.
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探讨远期移植肾丢失原因
不断提高移植肾长期存活率是移植医生与受者共同迫求的目标.过去的20年,肾移植后急性排斥反应明显减少,但远期移植肾丢失率仍维持在4%～6%.曾经将远期移植肾丢失原因主要归结于肾纤维化、药物毒性或慢性移植肾肾病,针对这些损害因素进行的治疗策略改变并未取得移植肾长期存活率的提高.以计划性移植肾穿刺活检为基础,结合实验室相关检测技术,为我们了解移植肾丢失病因提供了技术保障.当前,特别要重视抗体介导的排斥反应、肾病复发或新发以及多瘤病毒肾病所引起的移植肾丢失.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用. 方法:扩增HCV NS5A基因,构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达;与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性. 结果:质粒pcDNA3.1(-)-NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白,共转染实验中pcDNA3.1(-)-NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的 3.8 倍. 结论:构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白,并能够反式激活SV40病毒早期启动子.本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因,深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子/增强子的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用.方法:以重组质粒pcDNA3-core(含有HCV核心蛋白编码基因)转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子/增强子功能的影响.结果:质粒pcDNA3-core在HepG2细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5.4倍.结论:HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子/增强子的特性,为进一步以差异显示逆转录聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础.
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小鼠多瘤病毒荧光PCR检测方法的建立及其在裸鼹鼠感染情况调查中的应用
目的 建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查.方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC 001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证.人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本.结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性.结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考.
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BK病毒相关性肾病的诊治特点及相关临床因素分析
目的 了解BK病毒相关性肾病(BKVAN)在肾移植受者中的发病情况，观察BKVAN的病理特点。方法 对1999年12月至2008年1月中山大学附属第一医院行移植肾穿刺活检的137份组织标本进行BK病毒的免疫组织化学染色，并对免疫组织化学阳性的肾组织标本及尿中脱落的肾小管上皮细胞进行透射电子显微镜检查，了解BKVAN的发病相关因素、临床表现、诊治特点及预后。应用Kaplan-Meier分析计算BKVAN患者1、3年移植肾存活率。结果 137份移植肾标本中共诊断BKVAN 16份（分属16例患者），占11.7％。其中3份肾组织和7份尿沉渣肾小管上皮细胞核内发现直径为35 ～40 nm的病毒颗粒。16例BKVAN患者既往发生过急性排斥反应及使用过多/单克隆抗体者各7例，免疫抑制方案为他克莫司+酶酚酸酯的10例，14例表现为血清肌酐升高类似急性排斥反应。4例患者在使用强效免疫抑制剂后移植肾失功能，8例患者接受减少免疫抑制剂或转换免疫抑制剂治疗后肾功能得到改善，其余4例患者免疫抑制方案未予调整终移植肾功能恶化或失功能。BKVAN受者1、3年移植肾存活率分别为81.3％、54. 2％。结论 对于移植后肾功能减退，尤其是有BKVAN高危因素者，要考虑到BKVAN的可能。而BKVAN的临床及病理表现与急性排斥反应相似，免疫组织化学方法或电镜可以鉴别。正确的、适量的减少免疫抑制剂强度治疗BKVAN效果好，相反可加快BKVAN的进展。
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SV40T抗原荧光真核表达载体构建及在胰岛细胞中的表达
背景:有研究表明小鼠胰岛细胞永生化以后增殖能力明显增强,但功能减弱.然而,小鼠的端粒和人类的端粒有差别,大鼠的端粒与人类的相似.目的:设计和构建SV40T荧光真核表达载体,导入大鼠胰岛细胞中进行表达鉴定.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-10/2008-04在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:选用成年雄性SD大鼠2只;pCMV-SV40T质粒:pSC-A质粒;plRES2-ZsGreenl质粒.方法:用Not I和Xho I将SV40T片断从pcMV-SV40T质粒上双酶切下来,同收后克隆到载体pSC-A中成为pSC-SV40T,再用Xho I和Sac II将SV40T片断双酶切下来,回收后正向克隆到荧光真核表达载体plRES2-ZsGreen I中,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的力法将构建的载体导入原代培养的人鼠胰岛细胞:检测SV40T基因在胰岛细胞中的表达.主要观察指标:绿色荧光蛋白的表达:SV40的转录和翻译.结果:[1]经Xho I和Sac II双酶切后,重组质粒被切成5.3 kb和2.4 kb 2个片段,与理论预期长度相符.[2]pIRES2-ZsGreenl-SV40T重组基因经脂质体法转染,G418筛选,在胰岛细胞内町见绿色荧光,反转录-聚合酶链反应及细胞免疫荧光染色可见SV40T mRNA转录及其蛋白的表达.结论:实验成功构建了SV40T荧光真核表达载体,并可在大鼠胰岛细胞中表达.
