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板层状鱼鳞病TGM1基因突变的研究
目的 探讨一个板层状鱼鳞病家系转谷氨酰胺酶Ⅰ编码基因TGM1的致病性突变.方法 提取板层状鱼鳞病患者及家系成员的外周血基因组DNA,采用PCR扩增TGM1基因15个外显子及外显子-内含子交界处,并行双向直接测序.结果 患儿携带TGM1基因复合性杂合错义突变c.424C＞T(p.R142C)和c.967C ＞T(p.R323W),分别遗传自表型正常的母亲和父亲.结论 复合性突变c.424C ＞T和c.967C ＞T可导致板层状鱼鳞病的发生.
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两个无先证者标本的火棉胶样婴儿家庭的产前诊断
目的:在2个无患儿生物学标本的火棉胶样婴儿家庭中确定致病基因突变位点,并为其提供产前诊断.方法:收集已逝火棉胶样婴儿临床病史,依据引起该病的候选致病基因进行排序,在患儿父母中逐一进行候选致病基因突变位点检测.确定突变位点后,分别在孕1 1周和孕18周时进行胎儿绒毛膜及羊水穿刺,对胎儿DNA进行致病突变位点检测,确定其基因型及患病情况.结果:两个家庭中分别分娩过2例和1例火棉胶样婴儿,均在出生不久后夭折,未能获取患儿任何生物学标本.笔者在家庭1的健康父母中分别发现TGM1基因c.C427T及c.1106delG杂合突变;在家庭2的健康父母中分别发现ALOX 12B基因c.1463G＞A和c.1642C＞T杂合突变.再次怀孕后,家庭1的胎儿绒毛膜组织标本未检测到TGM1的任一致病突变位点;家庭2的胎儿羊水标本中检测到c.1463G＞A突变,但未发现c.1642C＞T突变,诊断该胎儿为健康携带者.两个家庭胎儿出生后均为健康婴儿.结论:虽然多数火棉胶样婴儿病情危重,可导致早天,但可根据该病的候选致病基因排查结果在缺乏患儿DNA标本的家庭中进行基因诊断和产前诊断.
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板层状鱼鳞病两家系TGM1基因的突变
目的:检测2个板层状鱼鳞病家系TGM1基因的突变情况.方法:采用PCR-DNA直接测序方法明确两个家系TGM1基因突变位点,并以免疫组化的方法检测其中一家系患者皮肤中转谷氨酰胺酶的活性.结果:在1个家系的患者中发现TGM1基因第13号外显子第2060位碱基发生G→A纯合突变,使密码子CGT→CAT,导致R687H突变:在另一个家系的患者中发现TGM1基因第4号内含子第一个核苷酸发生G→T及第5号外显子第760位碱基发生G→A杂合突变,分别导致IVS4+1G＞T及D254N的复合杂合突变,其父母均为相应突变的携带者.在50名无关正常人中未发现相同突变.R687H纯合突变患者皮肤转谷氨酰胺酶的活性降低.结论:R687H纯合突变及D254N和IVS4+1G＞T复合杂合突变为新发现的TGM1基因突变位点,可能是引起两家系板层状鱼鳞病患者的病因.
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板层鱼鳞病患者指甲内皮蛋白与TGase1酶的表达及其TGM 1基因序列分析
目的 观察板层鱼鳞病(LI)患者指甲转谷氨酰胺酶 1(Tgase 1)与内皮蛋白的表达变化,分析其TGM 1基因序列.方法 分别自8例LI患者(LI组)和8例健康人(C组)的指甲中提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳,分别采用免疫印迹及斑点印迹法检测内皮蛋白和Tgase 1.对LI组不同家系两个家族的2例患者血液进行TGM 1 基因序列分析.结果 LI组指甲总蛋白SDS-PSGE 电泳呈5条主带,即38、48、54、63、69 kDa,而C 组仅呈现前4条主带.LI组内皮蛋白主要定位于63、69 kDa主带,C组内皮蛋白仅定位于63 kDa主带.两组内皮蛋白及TGase1的灰度值(GSM)相比,P均＜0.05.2例 LI 患者TGM 1基因序列第8、12、13 外显子皆有错义的点突变.结论 LI患者的指甲内皮蛋白过度表达、 Tgase 1低表达,TGM 1 基因序列异常.
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TGM1基因RNA干扰表达载体pLVX-siTGM1的构建与鉴定
目的:构建针对转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)的shRNA表达载体,通过脂质体进行HaCaT细胞内转染,筛选出显著抑制TGM1的shRNA干扰载体.方法:构建三个针对TGM1基因的RNA干扰质粒:pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段测序分析验证构建效果.脂质体介导质粒转染HaCaT细胞.实时定量RT-PCR检测TGM1 mRNA的表达,Western blot检测TGM1蛋白的表达.结果:重组构建的三个干扰载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,三对碱基成功插入到预计位点,序列完全一致.转染三个重组干扰表达载体72小时后,RT-PCR检测TGM1基因沉默的效率,pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi分别为62.4％、73.5％和91.3％;Western blot检测TGM1蛋白的表达水平均明显降低,其中pLVX-1649shRNAi干扰载体降低明显.结论:成功构建了TGM1 shRNA重组慢病毒载体,并且筛选出有效抑制TGM1表达的干扰载体pLVX-1649shRNA,为进一步研究TGM1基因在鱼鳞病发病中的功能奠定基础.
关键词： pLVX-shRNA1系统 RNA干扰 TGM1基因 HaCaT细胞 -
一例火棉胶婴儿TGM1基因新的复合杂合性突变鉴定
目的 鉴定1例火棉胶婴儿转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)的致病性突变.方法 提取患儿及其父母的外周血DNA,PCR扩增TGM1基因的编码及剪切位点序列,对PCR产物进行直接测序.同时检测100名无血缘关系的正常人作为对照.用TGM1邻近的微卫星标记在家系中构建单倍型以确定突变的来源.应用CLUSTAL X(1.81)软件分析突变氨基酸的跨种属保守性.结果 患儿携带了TGM1的两个复合杂合性突变:c.420A＞G (I140M)及c.832G＞A (G278R),均为国际上未报道过的新突变.两个错义突变均造成了TGM1蛋白内高度保守区的氨基酸置换.突变c.420A＞G (I140M)遗传自父亲,位于蛋白的转谷氨酰胺酶N功能域；突变c.832G＞A (G278R)遗传自母亲,位于野生蛋白的转谷氨酰胺酶N功能域和转谷氨酰胺酶样功能域之间.两个突变在100名无血缘关系的正常人中均未发现.结论 c.420A＞G (I140M)和c.832G＞A (G278R)复合杂合性突变为该患儿的致病性突变,本研究结果为该病的诊断提供了分子学依据.
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一例火棉胶样儿TGM1基因的突变分析
目的 对1例维吾尔族火棉胶样患儿的TGM1基因进行突变分析,寻找其病因.方法 对患儿及其父母进行常规染色体G显带核型分析,应用芯片高通量测序方法对患儿进行鱼鳞病及鱼鳞病样皮肤病25个相关基因的检测.结果 染色体G显带核型分析结果显示患儿及父母核型均正常;芯片捕获高通量测序检测出患儿TGM1基因的c.919C＞T(p.Arg307Trp)和c.856C＞T(p.Arg286Trp)复合杂合突变;前者为已知致病突变,后者为临床意义未明突变.Sanger测序验证,患儿父亲携带TGM1基因c.856C＞T(p.Arg286Trp)杂合突变,未检出患儿母亲TGM1基因c.919C＞T、c.856C＞T的位点突变.结论 TGM1基因c.919C＞T和c.856C＞T复合杂合突变可能是患儿的致病原因.
