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葛根素通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路刺激 成骨分化和骨形成的机制
目的 探究葛根素通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路刺激成骨分化和骨形成的机制.方法 分离培养成人成骨细胞(MC3T3-E1),运用MTT法对比加入不同浓度葛根素后细胞增殖能力和对生长曲线的影响.通过测定碱性磷酸酶活性检测葛根素对成骨细胞分化的影响.通过测定钙沉积量分析葛根素对骨形成的影响.通过ERKl/2阻断剂PD8089,p38抑制剂SB203580的加入分析ERK1/2和p38 MAPK信号通路刺激成骨分化和骨形成的机制.利用蛋白质免疫印迹(WB)检测细胞骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达.结果 不同浓度葛根素干预成骨细胞,可以不同程度上促进其增殖,1μmol/L葛根素组效果明显.第1天和第3天较空白组增殖趋势不明显,第5天和第7天较空白组有明显差异.葛根素可以激活碱性磷酸酶活性,初级成骨细胞分化.葛根素可以促进钙的沉积,刺激骨形成.使用ERK1/2阻断剂PD8089后,或用抑制剂SB203580阻断p38 MAPK信号通路后,细胞增殖、碱性磷酸酶含量以及钙沉积量均较葛根素组有所下降.葛根素组(T group)BMP-2表达高于对照组(P<0.05);葛根素+PD8089组(T+PD group)低于T组高于对照组;葛根素+SB203580组(T+SB group)钙沉积量较T组明显降低(P<0.05),与对照组BMP-2表达量相比亦降低(P<0.05).结论 葛根素在骨细胞周期过程中,ERK1/2和p38 MAPK信号通路对骨分化和骨形成起到了调控作用.
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金雀异黄素对骨肉瘤细胞U2OS细胞生长和分化的影响
[目的]探讨植物雌激素类药物金雀异黄素(genistein,GEN)对骨肉瘤细胞U2OS生长的影响作用.[方法]用不同浓度的GEN处理U2OS细胞,分别在24、48和72 h采用MTT法检测细胞增殖抑制情况,用酶活性法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphate enzyme,AKP)活性和ELISA法检测骨钙素(osteocalcin,BGP)的表达.[结果]MTT检测显示,GEN对U2OS细胞生长的影响与GEN作用时间及浓度有密切关系,当GEN浓度增加至10 000 nmol/L时,OD值远低于对照组(P＜0.05),而在低浓度(0.1 nmol/L和1 nmol/L) GEN作用72 h后,OD值又远高于对照组(P＜0.05);AKP活性检测表明,高浓度(10 000 nmol/L)GEN作用48 h和72 h能明显抑制AKP的活性(P＜0.05),而低浓度(0.1 nmol/L) GEN却能增加AKP的活性(P＜0.05);ELISA实验表明,GEN处理U2OS细胞后对其BGP表达的影响作用也同样表现为与药物浓度及培养时间有关,作用48、72 h后,BGP的表达随着药物浓度的降低却有明显的增加.[结论]GEN除了能抑制U2OS细胞的增殖、具有抗肿瘤作用外,低剂量应用时具有促进成骨分化作用,其作用机制可能与其激活雌激素受体有关.
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Wnt5b在葛根素促进成骨分化中的作用
目的:探索对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)具有佳促成骨能力的葛根素浓度以及与Wnt信号通路之间的相关性.方法:取3周龄的SD大鼠,分离培养BMMSCs,传至第3代后接种,改用含不同浓度葛根素的培养基.继续培养2～4周,测定碱性磷酸酶与骨钙素的含量,评价葛根素的体外诱导成骨能力.用Elisa试剂盒测定Wnt5b的含量,评估葛根素的促成骨作用与Wnt信号通路的关系.采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:不同浓度组的细胞ALP、OCN和Wnt5b含量增加,10-5 mol/L组显著高于对照组,高于其他浓度组,但差异无显著性.结论:葛根素能有效促进BMMSCs向成骨方向分化,以10-5 mol/L浓度效果佳,其作用机制可能与Wnt信号通路有关.
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葛根素诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究
目的：通过体外实验探讨不同浓度的葛根素诱导骨髓间充质干细胞（ bone marrow－mesenchymal stem cells ，BMSCs ）骨组织分化的作用以及与Notch信号通路之间的关系。方法根据葛根素的浓度，实验分为6组。取3周的SD大鼠分离培养BMSCs，传至第3代后接种细胞，改用不同分组的培养基。继续培养2～4周，测定碱性磷酸酶（ ALP）与骨钙素（ OC）的含量，评价葛根素的体外诱导成骨能力。用Elisa试剂盒测定Delta样配体4（ DLL4）的含量，评估葛根素的促成骨作用与Notch信号通路的关系。结果不同浓度组的细胞出现与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，ALP、OC和DLL4含量增加，但以1×10－5 mol／L组显著高于对照组，比其他浓度组要高，但是差异无统计学意义。结论葛根素能有效促进BMSCs向成骨方向分化，以10－5 mol／L浓度效果佳，其作用机制可能与Notch信号通路有关。
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转化生长因子-β3对兔牙髓干细胞增殖及骨向分化的影响
目的 探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)对体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)增殖和分化的影响.方法 采用酶解组织块法将兔DPSCs分离培养获得DPSCs,光镜下行形态学观察;将体外培养的第3代DPSCs分为5组,分别为对照组、20 μg/L TGF-β3组、40 μg/L TGF-β3组、80 μg/L TGF-β3组和100 μg/L TGF-β3组,分别加入0、20、40、80、100μg/L TGF-β3;采用MTT法检测5组DPSCs A490值,采用免疫细胞化学法检测成骨细胞标记物骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原酶(collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)表达情况,采用茜素红染色检测出现矿化结节情况,并进行比较.结果 兔DPSCs呈集落状生长,在体外有一定克隆形成能力;对照组及20、40、80、100 μg/L TGF-β3组兔DPSCs A490值分别为0.34±0.55、0.34±0.19、0.33±0.47、0.33±0.30、0.34±0.47,各组间两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05);80、100 μg/L TGF-β3组诱导后第3天出现Col-Ⅰ阳性表达,第7天开始消失,第5～7天出现BSP阳性表达,第7～14天出现OC阳性表达,第7天出现矿化结节;40 μg/L TGF-β3组第5～7天均有Col-Ⅰ阳性表达,第7天出现BSP阳性表达,第14天出现OC阳性表达,第14天出现矿化结节;20 μg/L组第7天出现Col-Ⅰ阳性表达,第14天消失,第14天出现BSP阳性表达,第21天出现OC阳性表达,第21天出现矿化结节;对照组Col-Ⅰ、BSP和OC均为阴性,未出现矿化结节.结论 TGF-β3对体外培养的兔DPSCs增殖无影响,但对兔DPSCs向成骨细胞分化能力有一定促进作用,并在一定范围内呈浓度依赖关系.
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Wnt3a联合骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
目的 观察经典Wnt/β-catenin以及骨形态发生蛋白(BMP)信号通路对大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)体外增殖以及向成骨方向分化的影响.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞并分4组:对照组、Wnt组、BMP组、Wnt3a和BMP-2联合组,在不同时间点用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定、Yon Kossa染色观察细胞向成骨分化和基质矿化程度.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨特异性标志物表达.结果 培养第7天,CCK-8测吸光度值联合组为0.845,Wnt组为0.738,明显高于对照组0.409(P＜0.05).培养第6天和第12天,ALP活性吸光度值联合组为63.8和144.3,BMP-2组为40.8和104.1,均明显高于对照组7.3和18.9(P ＜0.05).培养14 d后,联合组骨钙素mRNA表达量高于对照组,而Runx2及Osterix表达量与其他组比较增高不显著.培养3周后,Yon Kossa染色显示联合组钙结节数量及大小均高于对照组.结论 Wnt3a因子和骨形态发生蛋白-2联合诱导能有效地促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨方向分化.
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长期动态机械拉伸力诱导类骨细胞的分化及成熟
目的 探讨长期动态机械拉伸力对类骨细胞分化及成熟的影响.方法 利用机械形变发生装置拉伸类骨细胞,分析类骨细胞是否因拉伸力而使分化更趋成熟.应用Flexercell Strain Unit机械力拉伸装置对MG63及C2C12细胞株施加0～10%的拉伸形变72 h.通过碱性磷酸酶(ALP)染色、RT-PCR反应及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)添加测试来检测长期动态机械拉伸力对类骨细胞分化的影响.结果 拉伸力使MG63细胞的ALP活性约增加2倍,RT-PCR检测显示骨标志物[骨钙素(OCN)及ALP]表达均因拉伸力作用而增加.而单独施加拉伸力并不能增加C2C12肌原细胞内ALP的活性.添加BMP-2培养能促进C2C12细胞向骨细胞分化,并增加细胞ALP的活性.在BMP-2刺激下拉伸力可使C2C12细胞内ALP的活性增加2倍以上.结论 本研究确立10%拉伸力能促进类骨细胞向骨细胞分化.对于未分化的肌原细胞,拉伸力刺激并不能使其直接向骨分化,但却能使分化中的骨细胞加速分化或成熟.
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微小RNA在骨分化过程中的作用机制
在口腔种植治疗过程中常常会遇到骨量不足的问题，植入骨替代材料是目前临床上主要的重建骨缺损方法之一，因此骨替代材料的成骨性能及其分子机制成为了研究热点。微小RNA（miRNA）是一种短链非编码RNA，通过转录后调控细胞分化、增殖、程序性死亡等病理生理过程。miRNA可影响成骨相关因子的表达和激活成骨相关信号转导通路中的信号转导，从而对骨组织动态改建过程进行调控。本文就miRNA与成骨细胞特异性转录因子、核心结合因子-α1基因、Smad基因、转化生长因子-β诱导因子，与骨形态发生蛋白信号转导通路、无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族信号转导通路、促丝裂原激活蛋白激酶信号转导通路、成脂信号转导通路以及miRNA与口腔相关材料和miRNA在骨缺损修复中的应用研究进展作一综述。
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成纤维细胞生长因子在骨形成及骨分化过程中作用的研究进展
成纤维细胞生长(FGF)因子通过其受体(FGFR)调控广泛的生物学效应，包括细胞增殖、存活、迁移和分化等。 FGF可以通过RAS/MAPK、PI3K/AKT和PLCγ等信号通路发挥作用，而其中RAS/MAPK信号通路已被了解是起主要作用。近一些研究也证明了体外研究FGF对组织再生的生物学作用，未来的研究重点是FGF在神经传导系统和组织再生中的研究，包括皮肤、血管、肌肉、脂肪、软骨及骨等方面的研究，而本文将着重于介绍FGF在骨及软骨分化及形成方面的作用，包括已经被报道的促进或者抑制等，对其在骨方面的作用进行比较全面的综述。
