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脂肪细胞因子 CTRP4转基因鼠的构建与鉴定
目的：建立人CTRP4基因的转基因小鼠，为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体，再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵，从而构建人CTRP4的首建鼠（ Founder ）并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠，再通过近亲繁殖与测交的方法，得到CTRP4转基因纯合子小鼠，并通过PCR和western blot 的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系，western blot鉴定该转基因小鼠心脏，肝脏，脑，肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。
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人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备
目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础.方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4.构建好的质粒在E.coli BL21( DF3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度.将pcDNA3.1-myc/his(-) B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体.并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定.结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95％以上.ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白.结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体.
