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感染人乳头状瘤病毒的人喉咽鳞癌FaDu细胞系的建立
目的：建立稳定感染人乳头状瘤病毒(HPV)阳性的人喉咽鳞癌FaDu细胞系，为体外研究下咽鳞癌提供理想的实验模型。方法重组HPV-16 E6-E7慢病毒，并用其感染人喉咽鳞癌FaDu细胞。RT-PCR和Western blot检测慢病毒稳定感染的FaDu细胞E6、E7 mRNA和蛋白表达情况。结果获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu细胞。结论成功建立人乳头状瘤病毒感染的人喉咽鳞癌FaDu细胞系。
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PDGF-BB 对Fadu 细胞增殖侵袭的影响及可能的机制研究
目的:研究不同浓度血小板衍生生长因子PDGF-BB诱导后Fadu细胞增殖侵袭能力及粘着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)表达的变化.方法:不同浓度(0,1,10,20,100 ng/mL)PDGF-BB诱导人下咽癌Fa-du细胞株,RT-PCR方法检测FAK及MMP9、MMP2mRNA表达变化,噻唑蓝法(MTT)检测细胞增殖,侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测不同浓度PDGF-BB处理后Fadu细胞蛋白表达变化.结果:诱导后细胞FAK、MMP9、MMP2mRNA水平上调,在20 ng/mL或10 ng/mL浓度时达到高(与对照组相比P<0.05);各组蛋白表达增加与mRNA基本一致,在20 ng/mL达高峰(与对照组相比P<0.05),MTT示各组增殖无明显变化(与对照组相比P>0.05).诱导后侵袭细胞数在各组均有增加,在20 ng/mL组达高峰为(20.12±4.5)个,较对照组差异有统计学意义(P<0.05).结论:PDGF-BB上调Fadu细胞中FAK、MMP9及MMP2表达,从而使Fa?du细胞侵袭能力增强,但对Fadu细胞增殖无明显影响.
关键词： 粘着斑激酶 血小板衍生生长因子-BB 增殖 侵袭 FaDu细胞 -
p27及HIF-1α在二甲双胍调节下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用研究
目的 探讨二甲双胍在下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用,以及p27和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)蛋白在该调节机制中的作用,为临床治疗下咽癌提供进一步的理论基础.方法 以0、5、10 mmol/L二甲双胍干预体外培养人下咽癌Fadu细胞24 h,5 mmol/L组再干预至48 h,应用免疫细胞化学法检测p27和HIF-1α蛋白的表达.下咽癌移植瘤裸鼠随机分为对照组(不予二甲双胍干预),低剂量二甲双胍治疗组(met 40组,每日40 mg/kg),高剂量二甲双胍治疗组(met 200组,每日200 mg/kg),各5只,腹腔注射给药28 d后,取移植瘤测量肿瘤体积,计算抑瘤率;HE染色观察肿瘤细胞形态,免疫组织化学染色法检测p27和HIF-1α蛋白表达水平的变化.结果 体外培养的Fadu细胞p27蛋白表达随二甲双胍干预浓度的增加及干预时间的延长而增加(P均<0.05),而HIF-1α蛋白表达随二甲双胍干预浓度的增加及干预时间的延长而降低(P均<0.05).下咽癌移植瘤裸鼠药物干预后,met 40组和met 200组移植瘤体积均较对照组缩小(P均<0.05);移植瘤标本p27蛋白表达随给药浓度的增加而增加,HIF-1α蛋白表达随给药浓度增加而降低(P均<0.05).结论 二甲双胍可有效抑制下咽癌细胞体内、体外的增殖并促进其凋亡,为临床治疗下咽癌提供进一步的理论依据.
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不同剂量柚皮素对FADU细胞生长的调节及机制研究
目的:探究不同剂量柚皮素(naringenin)对人下咽癌FADU细胞的作用及其相关机制.方法:以不同剂量(0、100、200、400、800μg/mL)柚皮素对FADU细胞进行处理,倒置显微镜观察细胞形态学变化;cck-8法检测药物作用后不同时间(24、48、72 h)FADU细胞增殖的变化;流式细胞仪检测柚皮素作用48h细胞凋亡的变化;采用Transwell趋化小室体外侵袭实验测定48h后细胞的侵袭能力的变化;蛋白免疫印迹法检测48h后细胞内PI3K/AKT信号通路凋亡相关蛋白表达的影响.结果:cck-8法检测发现柚皮素抑制FADU细胞增殖作用明显,呈浓度和时间依赖性;流式细胞结果发现200,400,800 μg/mL柚皮素作用48 h后,FADU细胞的凋亡率显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).Transwell体外侵袭实验发现,随着柚皮素浓度增加,FADU细胞穿透聚碳酸酯滤膜的能力逐渐减弱,柚皮素有效的抑制FADU细胞在体外的侵袭能力,呈浓度依赖性.同时,蛋白免疫印迹法凋亡相关蛋白检测结果表明,FADU细胞内BCL2、P-AKT和P-PI3K蛋白表达均受到明显抑制.结论:柚皮素能有效抑制人下咽癌FADU细胞的增殖、体外侵袭能力,诱导细胞凋亡;其机制与下调PI3K/AKT信号通路凋亡相关蛋白表达有关.
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雷公藤红素对FADU细胞增殖抑制和促进凋亡作用
目的:探索不同浓度雷公藤红素(celastrol)对下咽癌FADU细胞增殖抑制及促进其凋亡的机制.方法:用不同浓度(0μmol/L,1 μmol/L,3 μmol/L,5 μmol/L)雷公藤红素作用于FADU细胞,倒置显微镜下观察雷公藤红素干预后细胞形态变化情况;CCK-8法检测不同时间段(24、48、72 h)药物干预后FADU细胞的增殖变化;流式细胞仪检测雷公藤红素干预24h后细胞凋亡率变化;Western-Blot检测不同药物浓度作用24h后FADU细胞PI3K信号通路中与凋亡相关的关键蛋白的表达变化情况.结果:与对照组相比,在倒置显微镜下FADU细胞形态明显改变,细胞数量明显减少,细胞边界模糊不清,漂浮细胞增多,而随着用药浓度的增加细胞的增殖能力被显著抑制,PI3K、AKT、P-mTOR、Bcl-2蛋白表达明显减少,并且肿瘤细胞的凋亡率明显增高.结论:雷公藤红素对FADU细胞具有显著的增殖抑制效果,同时能够促进细胞凋亡,其原理主要与通过下调PI3K信号通路凋亡相关蛋白的表达有关.
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姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制研究
目的 探讨姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制.方法 用姜黄素和白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌细胞株)及FaDu(人下咽癌细胞株),应用MTT(塞唑蓝)比色法检测细胞增殖抑制率,平板克隆增殖实验检测单个细胞集落形成能力,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,同时应用Real-time PCR法检测Bax和Bcl-2的mRNA表达水平.结果 姜黄素和白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞增殖有抑制作用,二者联合处理后,对细胞增殖、细胞克隆形成能力及细胞凋亡的抑制均明显增强;同时,姜黄素和白藜芦醇上调细胞中Bax和下调Bcl-2的mRNA水平.结论 姜黄素与白藜芦醇联合处理可抑制Hep2及FaDu细胞增殖,作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2基因表达有关.
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稳定感染HPV-16E6-E7的人喉咽鳞癌FaDu细胞生物学特性观察
目的:观察稳定感染HPV-16 E6-E7对FaDu细胞生物学行为的影响和调控.方法:全基因合成HPV-16E6-E7基因,将其与慢病毒载体pLV-EGFP-C在T4连接酶作用下连接.制备重组HPV-16 E6-E7慢病毒并感染FaDu细胞.将细胞分3组:实验组(重组HPV-16 E6-E7慢病毒稳定感染的FaDu细胞)、载体对照组(慢病毒空载体稳定感染的FaDu细胞)和空白对照组(未感染慢病毒的FaDu细胞).分别用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力.结果:获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu细胞,荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光蛋白 EGFP表达.整合HPV-16 E6-E7基因的FaDu细胞增殖能力和侵袭力均增强,细胞凋亡率降低,S期和G2/M期细胞增加,G0/G1期细胞减少(P＜0.05).结论:成功建立了HPV-16 E6-E7基因整合的FaDu细胞.
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双氢青蒿素对人下咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的 明确不同浓度双氢青蒿素(DHA)抑制人下咽癌细胞Fadu裸鼠移植瘤生长的效应.方法 细胞克隆形成实验分析DHA体外抑制肿瘤形成能力;建立Fadu裸鼠移植瘤模型,腹腔注射低、中、高浓度DHA作为DHA处理组,腹腔注射顺铂作为化疗组;测量移植瘤的体积,干预3周后剥离瘤块,判断不同浓度DHA抑瘤率及抑瘤效果;根据体重变化及肝、脾、肾的重量变化,判断DHA是否有潜在的毒性.结果 (1) DHA抑制Fadu细胞的体外生长;(2) DHA低(25 mg/kg)、中(50mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组的抑瘤率分别为39.74％、60.52％、78.70％,顺铂组的抑瘤率为79.22％;(3)DHA对裸鼠体重及肾重量无影响,能增加荷瘤裸鼠的肝、脾重量.结论 低、中剂量DHA虽能抑制Fadu移植瘤生长,但抑瘤效果不如顺铂;高剂量DHA抑瘤效果与顺铂相同,且没有明显的肝、肾、脾毒性作用.
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丹参酮ⅡA通过下调survivin促进顺铂对咽鳞状细胞癌Fadu细胞抑制作用的研究
目的:研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)联合顺铂(DDP)对咽鳞癌Fadu细胞的肿瘤抑制作用及其机制.方法:利用CCK-8法检测TanⅡA联合DDP对Fadu细胞增殖抑制率的影响,流式细胞分析法检测细胞凋亡率变化及细胞周期分布情况,Western blotting法检测survivin、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白的表达水平.结果:与丹参酮ⅡA和顺铂单独作用相比,两药联合作用于下咽鳞癌Fadu细胞72 h后,细胞增殖受到明显抑制(均P＜0.01),细胞周期阻滞于S期,凋亡细胞比例增加显著;caspase-3和PARP剪切段蛋白表达增多,survivin蛋白表达明显减少(P＜0.01).结论:丹参酮ⅡA联合顺铂具有协同抗咽鳞癌Fadu细胞的作用,其作用机制可能与下调凋亡抑制蛋白survivin的表达有关.
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盐霉素对头颈部鳞状细胞癌Fadu细胞增殖和侵袭的影响
目的：研究盐霉素对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）Fadu细胞增殖和侵袭的影响，初步探讨盐霉素在HN－SCC发生发展中的作用。方法：不同浓度盐霉素（2、4、8、16μMmol／L）作用于Fadu细胞，分别处理12、24、36、48 h，用MTT法检测盐霉素对Fadu细胞增殖的影响，Transwell小室法测定盐霉素对Fadu细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blot法检测盐霉素对Fadu细胞中基质金属蛋白酶－7（MMP－7）、基质金属蛋白酶－9（MMP－9）和基质金属蛋白酶－13（MMP－13）蛋白表达的影响。结果：盐霉素呈时间－剂量依赖性抑制Fadu细胞的增殖（P＜0．05），使Fadu细胞的迁移和侵袭能力明显下降。盐霉素还使MMP－7和MMP－9蛋白的表达水平下调（P＜0．05）。结论：盐霉素可以降低Fadu细胞的增殖能力，抑制该肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，迁移和侵袭能力的改变可能与下调MMP－7和MMP－9的蛋白表达有关。
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STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达及对细胞凋亡的影响
目的：探索STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达情况及其表达沉默后对细胞凋亡的影响。方法培养人下咽癌FaDu细胞，根据不同慢病毒感染分2组。 STIM1-siRNA组为经STIM1-siRNA慢病毒感染的下咽癌细胞；对照组为经阴性对照慢病毒感染的下咽癌细胞。 Real-Time PCR法检测STIM1在人下咽癌FaDu细胞中的表达以及siRNA慢病毒感染后STIM1 mRNA水平的表达；Western blot检测siRNA慢病毒感染后STIM1在蛋白水平的表达；流式细胞仪检测STIM1基因沉默后的人下咽癌FaDu细胞的凋亡情况。采用SPSS 17．0软件对数据进行统计学分析。结果以GAPDH为内参（Ct＝12．08±0．05），STIM1在下咽癌细胞系FaDu中表达显著（Ct＝22．21±0．05，P＜0．01）；Real-time PCR结果显示对照组和STIM1-siRNA组人下咽癌FaDu细胞的表达值分别为（1．00±0．08）和（0．12±0．01），2组差异具有统计学意义（P＜0．01）；Western blot 的结果显示，STIM1-siRNA组FaDu细胞中STIM1蛋白明显受抑制，与Real-time PCR结果一致，慢病毒感染成功；流式细胞仪检测结果显示对照组凋亡率为（4．36±1．32）％；实验组凋亡率为（9．81±0．56）％，差异具有统计学意义（P＜0．05）。结论 STIM1基因与人下咽癌FaDu细胞凋亡显著相关，人下咽癌FaDu细胞中，STIM1可能抑制凋亡，可能成为下咽癌诊治的全新切入点。
