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镍转化人胚肺细胞中差异表达基因的克隆
目的 分析并克隆镍转化细胞与对照组细胞中差异表达的基因,以期了解镍化合物诱发癌变的分子机制. 方法 应用差异显示PCR方法分离对照和转化细胞间具有差异表达的基因,用TA Cloning方法将差异基因片段克隆到质粒中,循环测序,Northern杂交分析. 结果 从转化与对照细胞中分离并克隆到多个差异基因片段,Northern分析表明其中2个为确定的差异表达基因(暂称之为MS 515 和IC 82).测序后与基因库比较表明,MS 515与已知基因有80%以上的同源性,而IC 82为全新基因.具体功能有待进一步分析. 结论 镍化合物的致癌作用具有多样性,不同的镍化合物对不同的细胞其致癌机制不同,体现在对不同基因的作用不同.本研究中克隆到的差异基因可能在镍的细胞转化及致癌过程中起重要作用.
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热适应大鼠下丘脑基因差异表达的研究
目的从基因表达角度研究热适应的分子机制.方法制备热适应大鼠模型,分离热适应和常态大鼠各自的下丘脑组织,运用差异显示PCR技术筛选两种组织之间存在的差异表达基因片段,经斑点杂交鉴定后进行测序分析.结果从热适应大鼠下丘脑组织中分离并鉴定了一条表达增高的基因片段,经测序分析确定其为长164bp的cDNA序列.结论热适应大鼠下丘脑存在基因的表达增高,这种基因的表达水平的变化对于动物维持热适应能力可能具有重要作用.
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葡萄胎发病相关新基因F10功能的初步研究
目的 研究与葡萄胎发病相关的新基因F10的功能.方法 培养A549细胞,实验分4组:正向F10基因、反向F10基因、空载体分别转染A549细胞组、空白细胞组.转染24 h提取细胞mRNA.用差异显示(DDPCR)方法筛选4组之间差异表达的基因.结果 获得差异表达的条带,二次PCR扩增后产物连接T载体并测序分析,结果与GenBank数据库中的序列进行同源比较,筛选出几个差异表达的基因,经荧光定量PCR证实annexin I(钙依赖、磷脂结合蛋白)、STATI(信号转导子与转录激活子)、BASP1在正向F10基因转染组高表达.IPLA2、DATF1在正向F10基因转染组低表达.结论 F10基因可能是与细胞增殖和凋亡相关的基因.
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荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280
[目的]研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因.[方法]应用荧光差异显示PCR(FDD PCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northern blot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆.[结果]利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4 821 bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northern blot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13).[结论]应用荧光差异显示PGR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用.
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苦参碱诱导 K562 细胞分化相关 cDNA 的克隆
目的克隆苦参碱诱导人白血病K562细胞分化的相关基因,以求了解白血病细胞分化及苦参碱的作用机制.方法以人白血病细胞K562为研究对象,在苦参碱诱导其分化的基础上,利用mRNA差异显示技术对K562细胞在苦参碱诱导前及诱导后48小时的基因表达情况进行分析.结果在苦参碱诱导前后的K562细胞之间存在明显的基因表达差异,一些基因在诱导后表达增强,而一些基因经苦参碱作用后表达减弱甚至完全抑制.经克隆和筛选获得部分表达差异的cDNA片段,为进一步研究苦参碱的诱导分化机制及肿瘤细胞发生和分化机制打下了基础.结论苦参碱具有调控分化相关基因表达的作用,苦参碱诱导K562细胞分化是多基因共同参与的过程.
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牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达变化的初步研究
目的:采用差异显示反转录PCR技术,比较牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达的变化,初步筛选与细菌侵入宿主细胞相关的毒力致病基因.方法:提取纯培养状态和侵入KB细胞后的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277细菌总RNA；反转录PCR技术显示cDNA表达条带；筛选并回收差异表达条带,二次扩增cDNA,经测序和BLAST同源性比对,初步分析细菌侵入KB细胞后表达差异基因的功能.结果:共筛选获得3条牙龈卟啉单胞菌侵入KB细胞后表达存在差异的基因HX 01、HX 02、HX 03；BLAST同源性比对结果显示,HX 01与牙龈卟啉单胞菌ABC转运蛋白编码基因PG 0683具有96％的同源性；HX 02与牙龈卟啉单胞菌PepO)编码基因PG 0159具有97％的同源性；HX 03未找到类似同源性基因序列.结论:牙龈卟啉单胞菌在侵入KB细胞后发生了细菌毒力基因的表达变化,跨膜蛋白ABC转座子和PepO可能参与细菌侵入宿主细胞的致病过程.
