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人胚胎干细胞建系、培养及体外诱导分化研究现状
胚胎干细胞具有体外无限增殖和分化成三胚层细胞的潜能,它已被视为治疗多种疾病的一种新兴策略.目前胚胎干细胞常规的建系和培养技术已很成熟,并有一套国际公认的鉴定标准.但常规方法存在异源病原体污染的可能,急需研究适于标准化、无动物源性污染及可大量培养胚胎干细胞的培养体系.在现阶段,通过不同的体外诱导途径可将胚胎干细胞诱导成为胚外和三胚层来源的各种细胞,但定向分化的问题仍亟需解决.
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利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系
背景:目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法,但由于破坏胚胎,涉及诸多伦理问题.目的:探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性.设计、时间及地点:细胞学体内外实验,于2005-01/2006-08在沈阳市妇婴医院生殖中心完成.材料:妊娠13.5 d的ICR鼠20只用于制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验.行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎,由沈阳市妇婴医院生殖中心提供.方法:复苏冷冻的胚胎,采用序贯培养法进行囊胚培养,用免疫外科方法去除滋养细胞,将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代.主要观察指标:取不同代次的培养细胞,分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定.结果:20个解冻卵裂期胚胎,获得9个囊胚,分离完整的内细胞团共7个,从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细胞系,其中一个细胞系连续培养76代(20个月).所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性,即细胞呈扁平或圆形,可见1～3个核仁;碱性磷酸酶以及SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60,OCT-4均呈阳性表达,而SSEA-1呈阴性;核型正常,为46,XX核型;将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤,病理切片显示为成熟畸胎瘤;短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景.结论:实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后,多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性,是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源.
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人胚胎干细胞建系培养及体外诱导分化的研究进展
人胚胎干细胞具有发育全能性,在特定条件下能分化成多种类型的细胞.人胚胎干细胞的研究对人胚胎发育机制、人基因功能研究和治疗性克隆有着重大的意义.本文从人胚胎干细胞建系、培养及体外诱导分化等方面作一综述.
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人胚胎干细胞建系和培养的研究进展
人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)在再生医学、药物筛选和发育生物学等领域具有重要的研究和应用价值.本文对人胚胎干细胞建系方法的现状包括胚胎来源、内细胞团分离方法、以及人胚胎干细胞培养体系的改进作了介绍,讨论了与全能性维持和定向分化有关的信号通路的研究进展,以及胚胎干细胞研究中伦理问题的争议.
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提高人胚胎干细胞建系率的优选培养体系与方法
目的:建立一种从废弃胚胎中提高囊胚形成率和质量的培养体系,寻找多种促进内细胞团(ICM)数目增多、贴壁、增值的方法,提高人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)建系效率,建立人胚胎干细胞库.方法:将179枚IVFDay3废弃的胚胎放入优选培养体系中培养(G2.5培养液中添加10％人血清蛋白,人白细胞抑制生长因子(hLIF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)).到Day7将形成的囊胚全部用机械法分离ICM,接种于丝裂霉素C灭活处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上,培养8-9天,每4-5天传代1次.结果:优选培养体系的囊胚形成率为29.1％(52/179),其中A级囊胚形成率为11.2％(20/179),50个ICM贴壁生长,20个出现克隆形态,成功建立11株hESC(FY-hES-11至FY-hES-21).11株hESC均具有共同的多能性生物学特性.结论:优选培养体系可以明显提高囊胚形成的质量,促进ICM的增值,纯熟的机械切割法可以避免损伤ICM并提高其贴壁率,原代灭活的MEF饲养层可以明显促进细胞增殖.
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兔胚胎干细胞的早期培养条件初步研究
目的 探索小鼠胚胎内胚层细胞和鸡胚提取物(CEE)对兔胚胎干细胞早期培养的影响.方法 用全新的方法对兔胚胎干细胞的建系条件进行探讨.将分离到的囊胚期内细胞团接种到丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎内胚层细胞饲养层和几种不同的培养液构成的培养体系中,观察内细胞团的贴壁和生长状况,并对由内细胞团生长出的具有胚胎干细胞形态的细胞集落进行传代.结果 以灭活的小鼠胚胎内胚层细胞作为饲养层,以78%D-MEM/F-12+20%Knockout SR+2 mmol/LL-Glutamine+1%MEMNAA+0.1mmol/L β-mercaptoethanol+8ng/ml hrbFGF+2%CEE做培养液,兔内细胞团可以很好的贴壁,生长成具有标准的胚胎干细胞(ESC)形态的细胞集落.结论 小鼠内胚层细胞和CEE联合使用可以很好的支持原代兔胚胎干细胞(RESC)的生长,小鼠内胚层细胞和CEE中可能含有某些抑制RESC分化的因子.
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诱导性建立多能干细胞系
目的 建立多能干细胞系,并鉴定其是否具有正常干细胞的特性.方法 将原代皮肤标本用胶原酶消化处理,利用成纤维细胞培养基进行培养,然后感染病毒.对挑选的人成体细胞来源的iPS克隆进行扩大培养,并对克隆进行免疫荧光检测和RT-PCR检测,确定表达的分子标志,采用体外三胚层分化来鉴定其生物学特性.结果 所获得的iPS细胞经鉴定具有碱性磷酸酶活性,并表达Nanog、SSEA-4、Sox2、TRA-1-60等干细胞特异标记物,可形成拟胚体并在体内外可以分化为三胚层的细胞类型.结论 成功建立了iPS细胞系,为今后的研究提供了良好的细胞模型.
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高效种系嵌合能力的129/ter小鼠胚胎干细胞系GLDD-1的建立
目的建立具有高效种系嵌合能力的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)系.方法收集129/ter小鼠3.5天的囊胚,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经过4～6天的培养,离散明显增殖的内细胞团(ICM),经2次亚克隆纯化后,获得稳定传代的胚胎干细胞系.对获得的胚胎干细胞系进行核型分析,选择KY型胚胎干细胞进行显微注射,对小鼠胚胎干细胞整合进生殖系的能力进行分析.结果获得了4株(GLDD-1-4)能够稳定传代的小鼠胚胎干细胞系.4株细胞系的核型正常率均＞70%,其中GLDD-1、GLDD-2为XY型.通过囊胚显微注射法,将GLDD-1、GLDD-2ES细胞注入C57BL/6J小鼠的囊胚中,得到棕色嵌合体小鼠.选择高嵌合度小鼠与C57BL/6J小鼠杂交,获得了棕色子代小鼠.结论建立的2株129/ter小鼠ES细胞系具有种系嵌合能力,可用于利用基因打靶技术研制突变体小鼠的研究.
