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Pdx1与糖尿病的基因/细胞治疗
胰-十二指肠同源盒1(Pdx1)基因作为胰岛素基因转录激活的关键性调控因子,已成为糖尿病基因/细胞治疗策略中具希望的候选基因.利用Pdx1对非β细胞(包括肝细胞、小肠细胞、骨髓间充质细胞和胚胎干细胞)进行直接或间接的基因修饰和修饰细胞移植,并与其他辅助手段相协同,可有效启动胰岛素基因表达,从而改善糖尿病的高血糖症状.这一基因/细胞治疗策略为糖尿病的治疗提供了新的线索.
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高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用
背景:胰岛细胞移植是治疗1型糖尿病有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用.多能干细胞有望成为胰岛细胞移植的理想种子细胞,但其向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程.目的:构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体,探讨其实时监测诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化中关键性基因表达的可行性.方法:首先在pTiger载体上引入嘌呤霉素抗性,然后以646 bp的小鼠Ins1启动子替换了原来载体上410 bp的小鼠Ins1启动子,获得高效Pdx1/insulin双报告基因载体.后,将载体导入INS-1细胞和诱导多能干细胞,验证其功能.结果与结论:①实验成功构建了高效Pdx1/insulin双报告基因载体;②在INS-1细胞中验证了载体获得嘌呤霉素抗性,提高了insulin表达效率,并在INS-1细胞中检测到Pdx1和insulin的表达;③实验初步证明了Pdx1/insulin双报告基因能够有效监测细胞分化过程中Pdx1和insulin基因的表达.
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小分子化合物体外诱导肝上皮样干细胞-WB细胞表达PDX1
目的:近年来干细胞治疗糖尿病一直是国内外研究人员关注的焦点,而肝细胞向胰岛样细胞转变也是热点之一.本实验应用小分子化合物在体外诱导WB-F344大鼠来源肝上皮样干细胞(简写WB细胞)表达胰腺内分泌前体细胞基因PDX1,建立一种体外诱导WB细胞分化为胰腺内分泌前体细胞的实验方法.方法:选用5-AZA TSA,RA,ITS等小分子化合物,分两步法直接诱导WB细胞分化为表达PDX1的胰腺内分泌前体细胞,用含有不同浓度5-AZA分化培养基诱导WB分化,摸索诱导分化的佳条件.观察细胞形态变化,RT-PCR及实时定量PCR检测部分基因表达情况,免疫荧光检测PDX1的表达.结果:5AZA5 uM处理2d,TSA l d,RA联合ITS诱导7天,诱导的WB细胞表达PDX1较1-4 uM 5-AZA诱导强,并表达胰腺内分泌前体细胞的相关基因,NGN3,Neurod,NKX2.2,WB表达的Nestin仍持续表达,Insulinl有少量表达.WB表达的肝干细胞基因如ALB,AFP大量下调,标志分化的基因C/EBP下调.结论:5-AZA,TSA,RA,ITS等小分子化合物能够诱导肝上皮样细胞WB表达PDX1,并且这种诱导分化的细胞具有胰腺内分泌前体细胞特征.本实验进一步证明在体外微环境中,肝干细胞能向胰腺内分泌细胞转化,而肝细胞增极强,为将来干细胞治疗糖尿病提供充足的细胞来源
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PDX1真核表达载体的构建及其对PANC-1细胞PI3K/AKT信号途径的影响
目的 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX1)基因真核表达载体并转染至PANC-1细胞,观察其对PI3K/AKT信号通路的影响.方法 从Hela细胞中提取总RNA,逆转后PCR扩增PDX1编码区片段,然后将PDX1的CDS插入PCMV6-Entry质粒构建PCMV6-Entry-PDX1表达重组体.重组体转染至PANC-1细胞中通过G418筛选出稳定表达细胞株.Western blot分析PDX1蛋白水平表达及p-AKT水平变化.结果 PDX1基因成功在PANC-1中表达.利用West-ern blot检测验证获得了稳定的PDX1过表达细胞株.West-ern blot结果显示:过表达PDX1的细胞株AKT表达含量与正常细胞及对照细胞没有区别而p-AKT水平降低.结论 PDX1基因过表达能够降低PANC-1细胞的p-AKT水平.
关键词： Pdx1 基因重组 PI3K/Akt信号通路 PANC-1 -
PDX1、MafA、Ngn3及其联合作用的研究进展
胰腺十二指肠同源盒（PDX1）、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A（MafA）、神经元素3（Ngn3）是三个对胰岛发育有重要影响的转录因子。PDX1促进胚胎期胰芽形成，MafA促进β细胞终成熟，Ngn3始动内分泌祖细胞分化为内分泌细胞。PDX1、MafA、Ngn3是诱导分化的特定组合，其转分化效果优于任何单基因或双基因组合。携带有PDX-1、MafA、Ngn3的腺病毒诱导分化非β细胞，获得的胰岛样细胞与！源β细胞大小、形态相似，表达β细胞功能基因。
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启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化对胃癌中PDX1表达的影响
[目的]已知胃癌中PDX1表达下调,本研究旨在探讨DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰对PDX1基因表达的调控.[方法]免疫组化法检测胃癌组织芯片中PDX1、Dnmt1和HDAC的表达,分析其相关性.5’-aza-dC和TSA处理胃癌细胞,RT-PCR检测PDX1 mRNA水平,分析DNA去甲基化和组蛋白乙酰化对PDX1表达的影响;构建6个PDX1启动子片段至pGL3载体,检测转录活性,分析去甲基化和乙酰化对PDX1启动子转录活性的影响.MSP和BSP评估PDX1启动子DNA甲基化状态以及启动子活性受5’-aza-dC和SssI的影响;ChIP评估PDX1启动子组蛋白乙酰化状态以及启动子活性受TSA的影响.[结果]免疫组化结果显示与正常组织对比,胃癌组织中的PDX1表达下调,Dnmt1和HDAC表达上调,PDX1和Dnmt1及HDAC的表达负相关(P＜0.05);5’-aza-dC和TSA使PDX1在胃癌细胞中重获表达;F383是PDX1启动子核心,5’-aza-dC和TSA增强F383转录活性,SssI抑制F383转录活性;MSP结果显示F383在胃癌细胞中呈完全甲基化;BSP结果显示与对照比较,位于F383区域内17个CpG位点中80％以上呈现甲基化.ChIP分析结果提示F383呈组蛋白H3和H4低乙酰化.[结论]PDX1基因在胃癌中表达沉默与启动子DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化有关.
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胰十二指肠同源基因1在胃癌中的表达及对胃癌生物学行为的影响
[目的]明确PDX1基因在胃癌中的表达模式,探讨PDX1表达上调对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,从而揭示PDX1在胃癌发生发展中的作用.[方法]免疫组化法检测胃癌组织芯片的PDX1蛋白表达,RT-PCR和免疫印迹法检测3株胃癌细胞(AGS、SGC7901、BCG823)PDX1 mRNA表达;构建PDX1正义表达载体,瞬时转染胃癌细胞,免疫印迹法检测转染后PDX1、Ki-67、PCNA、Caspase3的表达,同时检测转染后胃癌细胞的增殖指数和凋亡指数.筛选PDX1稳定表达株,评价胃癌细胞伤口愈合、克隆形成、移植瘤形成等生物学行为.[结果]胃癌组织芯片包括171例腺癌,12例黏液腺癌,6例印戒细胞癌,5例未分化癌,7例恶性间质瘤,1例类癌,8例正常胃黏膜组织.PDX1蛋白在正常胃粘膜组织中腺上皮细胞的胞浆及胞核中高表达,胃癌组织中PDX1蛋白则表达下降甚至缺失(P＜0.05);肿瘤分化级别越高,PDX1表达随之下降(P＜0.05);与淋巴结无转移组比较,淋巴结转移组PDX1表达显著降低(P＜0.05).与正常对照相比,PDX1 mRNA和蛋白在胃癌细胞中表达微弱.瞬时转染PDX1正义表达载体后,PDX1表达明显上调,胃癌细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA下降,增殖指数显著下降;凋亡蛋白Caspase3被激活,cleaved-Caspase3被诱导表达,凋亡指数显著增加.与空质粒对照组比较,PDX1稳定过表达抑制了体外胃癌细胞的伤口愈合率以及克隆形成率和体内裸鼠移植瘤形成率(P＜ 0.05).[结论]PDX1基因在胃癌组织和细胞中表达下调,与癌组织淋巴结转移与分化程度有关;PDX1基因可能在胃癌发展过程中可能起着重要作用.
关键词： 胰十二指肠同源基因1 Pdx1 胃癌 生物学行为
