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Mir-217/Sirt1通路与糖尿病肾病
Mir-217是miRNAs家族的重要成员,在高糖培养的肾小球系膜细胞中表达量升高.Sirt1是一个NAD+调节的脱乙酰酶,既往在衰老性疾病中研究较多,近期发现其在糖尿病肾病中起到抗炎、抗氧化、抗纤维化等保护作用.研究指出,在多种病理条件下mir-217通过直接作用于Sirt1mRNA的3'非翻译区,显著抑制Sirt1蛋白表达,因此mir-217/Sirt1通路可能在糖尿病肾病的发生、发展中起关键作用.
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miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建
目的:构建miR-217慢病毒表达载体并建立稳定表达miR-217的胶质瘤细胞系,为深入研究miR-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件.方法:利用人基因组中miR-217前体序列,设计并合成引物.采用PCR的方法扩增含miR-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体pLVX-EGFP-Puro.将带有miR-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度.利用实时定量PCR检测miR-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力.将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染miR-217的胶质瘤细胞系.结果:克隆的miR-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变.实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,miR-217的表达水平明显升高(P＜0.01),表明miR-217慢病毒表达载体构建成功.经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且miR-217的表达水平显著升高(P＜0.01),是对照组的12.5倍.结论:成功构建了miR-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础.
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miR-217参与高糖诱导的内皮细胞凋亡的调控
目的:研究miR-217对高糖诱导的内皮刺激内皮细胞凋亡的作用.方法:培养人冠状动脉内皮细胞,用含D-葡萄糖(30mmol/L)的培养液刺激:(1)利用实时定量PCR检测内皮细胞相关微小RNA(miR-217、miR-137、miR-29c、miR-218、miR451、miR-328、miR-517c和miR-216a等)的表达变化;(2)利用慢病毒感染技术干预内皮细胞miR-217水平,利用流式细胞术检测细胞凋亡水平;(3)生物信息学预测、双荧光素酶报告基因验证以及蛋白免疫印迹法(western blot)确定miR-217的靶基因.结果:(1)实时定量PCR检测发现高糖刺激内皮细胞后,miR-217、miR-137、miR-29c、miR-218等的表达上调(P＜0.01),miR-451、miR-328、miR-517c和miR-216a的表达下调(P＜0.01),其中miR-217比对照细胞升高了5.67倍;(2)慢病毒感染内皮细胞后再经高糖刺激,流式细胞术检测发现过表达miR-217的内皮细胞凋亡水平有显著提高;(3)生物信息学分析发现SIRT1基因的3'非翻译区上存在一个miR-217的结合位点,双荧光素酶报告基因和western blot结果均证明SIRT1是miR-217的靶基因.结论:miR-217可能通过抑制SIRT1的表达参与高糖诱导的内皮细胞凋亡的调控.
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结直肠癌患者血清、粪便和癌组织中miR-21、miR-217、miR-29b和miR-92a-1的检测及其临床意义
目的:探讨结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)患者血清、粪便和癌组织中miR-21、miR-217、miR-29b和miR-92a-1的表达水平及其临床意义.方法:收集2016年7月至2017年5月在海南省中医院就诊的63例CRC患者,根据CRC有无远处转移将患者分为无转移组(n=35)和转移组(n=28);另选取同期体检的30例健康志愿者纳入对照组.采集所有受试者的血清、粪便及CRC组织,用RT-PCR检测标本中miR-21、miR-217、miR-29b和miR-92a-1的表达水平,并进行比较分析.结果:CRC患者血清中miR-21、miR-217、miR-29b和miR-92a-1表达水平显著高于对照组(均P＜0.05),以转移组中表达水平高(P＜0.05).CRC患者粪便中miR-21、miR-217和miR-92a-1表达水平显著高于对照组(均P＜0.05),无转移组miR-217表达水平显著低于转移组(P＜0.05),而miR-21、miR-29b和miR-92a-1在无转移组和转移组的差异无统计学意义(P＞0.05).无转移组CRC组织中miR-21、miR-29b和miR-92a-1均明显低于转移组(均P＜0.05),而miR-217表达水平显著高于转移组(P＜0.05).结论:miR-21、miR-217、miR-29b和miR-92a-1在CRC患者的血清、粪便和癌组织中异常表达,多种miRNAs的联合检测有利于对CRC的发生、诊治和预后的评估.
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MiR-217对小鼠胰腺成体干细胞增殖的调控作用
为了进一步研究miR-217在小鼠胰腺成体干细胞生长过程中的调控作用,在培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217,用Western blot和免疫荧光的方法检测miR-217对细胞增殖的影响.结果显示,miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达.使用生物信息学软件预测miR-217的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-217对靶点的靶向性,实验结果表明,miR-217能够抑制PMIR-REPORT-Sirt 1-3'UTR荧光素酶活性.进一步在二维培养的胰腺成体干细胞中,过表达miR-217检测Sirt1的表达变化,qPCR和Western blot表明在胰腺成体干细胞中miR-217能够抑制Sirt1的蛋白水平的表达,但对mRNA水平没有影响.在胰腺成体干细胞中分别加入Sirt1的抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇,尼克酰胺能够抑制胰腺成体干细胞的增殖,而白藜芦醇促进了胰腺成体干细胞的增殖.以上结果说明,miR-217通过Sirt1调控胰腺成体干细胞的生长,低表达的miR-217有助于维持胰腺成体干细胞的增殖.
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miR-217调控lncRNA MALAT1影响食管鳞癌细胞的生物学行为
目的 探讨miR-217通过调控lncRNA MALAT1抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖,迁移和侵袭行为及其机制. 方法 qPCR检测miR-217在食管鳞状细胞癌组织和不同细胞株中的表达情况;双荧光素酶报告基因检测miR-217与MALAT1之间的相互作用;MTT增殖实验检测抑制miR-217后食管鳞状细胞癌细胞的增殖能力的变化情况;划痕愈合试验和Transwell侵袭实验检测抑制miR-217后食管鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭行为的变化情况;Western blotting实验检测miR-217对MALAT1下游相关蛋白表达情况的影响.结果 与正常食管组织相比,食管鳞状细胞癌组织中miR-217的表达水平相对上调,与其他细胞株相比,Ec109细胞中miR-217表达高;双荧光素酶实验证实miR-217能与MALAT1的3'UTR特异性结合,可以调控MALAT1的表达与活性;抑制miR-217的表达后可以抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;抑制miR-217后MALAT1下游MIA2,ROBO1表达明显下调.结论 miR-217可以调控MALAT1的表达影响食管鳞状细胞癌细胞的生物学行为.
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人乳腺癌上皮细胞miR-217对DNMT1调控作用的研究
目的 验证在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达,为后期动物实验和临床试验提供实验基础.方法 利用瞬时转染技术,在对应细胞系中,过表达、抑制miR-217,Western blot检测各实验组中DNMT1蛋白表达,并用含有miR-217野生型及突变型识别位点的DNMT1 3′UTR载体质粒分别转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性改变.结果 过表达miR-217,DNMT1表达下降;抑制miR-217,DNMT1表达增高;双荧光素酶检测实验,DNMT1-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于DNMT1-UTR-MUT,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217对DNMT1表达具有调控作用,且miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达.
