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O-GlcNAc糖基化对Nalm-6细胞生物学行为及依托泊苷诱导凋亡的影响
目的 研究O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化及乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)对Nalm-6细胞生物学行为及对依托泊苷(Vp16)诱导凋亡的影响.方法 利用OGT抑制剂Alloxan构建低O-GlcNAc修饰的Nalm-6细胞模型,CCK-8法检测Alloxan对细胞增殖的影响,流式细胞术检测Alloxan对细胞凋亡及细胞周期的影响;以不同浓度的Vp16处理Nalm-6细胞12 h,Western blot检测O-GlcNAc糖基化修饰程度及OGT表达量的变化;以Alloxan处理Nalm-6细胞24 h后再加入Vp16(5μg/ml)处理12 h,应用流式细胞术检测不同组别细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况.结果 随着Vp16浓度的增加,Nalm-6细胞O-GlcNAc修饰及OGT表达均逐渐上调(P<0.05);Alloxan可抑制Nalm-6细胞增殖,诱发Nalm-6细胞凋亡[(15.190±2.539)%对(21.910±4.105)%,P=0.007],阻滞细胞周期[G1期:(43.534±4.453)%对(57.322±6.091)%,P=0.003;S期:(50.747±5.937)%对(37.201±4.661)%,P=0.001];Alloxan可抑制Vp16诱导的Nalm-6细胞凋亡[(75.195±13.845)%对(52.741±10.815)%,P=0.011],并伴随Bax表达下调(5.496±1.998对2.950±0.703,P=0.015)、Bcl-2表达上调(0.454±0.125对0.803±0.223,P=0.013).结论 通过抑制OGT而改变Nalm-6细胞O-GlcNAc修饰程度可影响其增殖、凋亡、改变细胞周期并抑制Vp16诱导的细胞凋亡.
关键词： Nalm-6细胞 O-GlcNAc 乙酰氨基葡萄糖转移酶 依托泊苷 糖基化 -
乙酰氨基葡萄糖转移酶KfiA的共表达与纯化
在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并纯化大肠杆菌K5中合成肝素前体的关键酶KfiA,为生物酶法合成肝素提供参考.提取大肠杆菌K5的基因组DNA,用PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到表达载体pET-21b中,使用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体与分子伴侣pGro7共转化大肠杆菌BL21(DE3),用L-阿拉伯糖和IPTG诱导表达,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE分析,优化表达条件;采用HisTrap FF琼脂糖凝胶柱对目的蛋白进行亲和纯化,并通过蛋白印迹法鉴定目的蛋白.结果:克隆出KfiA目的基因,构建了融合表达质粒pET-21 b/KfiA; SDS-PAGE检测表明获得了目的蛋白,用HisTrap FF琼脂糖凝胶柱纯化并通过蛋白印迹法确定得到纯度较高的蛋白.为进一步研究生物酶法合成肝素打下基础.
