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过表达RIPK3对SH-SY5Y细胞CX3CL1基因表达的影响
[目的]建立受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)过表达的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞模型,筛选表达水平受到RIPK3影响的基因,以探讨RIPK3在神经系统中可能具有的生物学效应.[方法]采用分子克隆的方式在实验组SH-SY5Y细胞内上调RIPK3的表达水平.激光共聚焦显微镜下观察GFP蛋白的表达情况确认转染结果;以Western blotting确认RIPK3表达变化.通过MTT实验中细胞增值活性的改变确认外源性RIPK3在细胞内是否具有生物学活性.通过转录组测序技术(RNAseq)从mRNA水平对对照组和实验组基因表达水平的变化进行检测,通过生物医学分析研发软件暨资料库(ingenuity pathway analysis,IPA)对RNAseq数据进行分析,获得重要的下游效应分子及相关信号通路,并对其相关作用分子表达发生的改变进行统计.采用Western blotting对部分实验数据进行验证.[结果]RIPK3表达水平上调后,实验组SH-SY5Y细胞增殖活性受到抑制,IPA分析结果显示:CX3CL1的表达水平出现明显上调;与其相关的部分信号分子也发生了相应的改变.其后Western blotting结果从蛋白水平验证了CX3CL1表达水平的变化.[结论]RIPK3能够在mRNA及蛋白水平上调节CX3CL1表达,并对其相关分子产生影响,进而在神经系统各种生理与病理条件下发挥重要的作用.
关键词： 受体相互作用蛋白激酶-3 CX3CL1基因 神经母细胞瘤 -
SH-SY5Y细胞中过表达RIPK3对ZFP36基因转录的影响
目的：探讨SH-SY5Y细胞中受体相互作用蛋白激酶-3（RIPK3）下游信号通路及其中的关键信号分子的作用。方法通过质粒转染的方式在实验组SH-SY5Y细胞内表达外源性RIPK3蛋白，将转染空载质粒载体SH-SY5Y细胞作为对照组。通过观察质粒所携带的绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达情况以验证转染结果，Western blot对外源性RIPK3表达进行验证。MTT法检测细胞增殖活性，观察过表达RIPK3对细胞活性的影响，以确认其在细胞内是否具有生物活性。运用转录组测序技术（RNAseq）分别检测2组细胞内基因转录丰度并应用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）数据库进行分析，获得RIPK3下游信号通路及关键分子。通过微滴式数字化PCR（ddPCR）对部分RNAseq结果进行验证。结果外源性RIPK3在细胞内具有生物活性，能够抑制SH-SY5Y细胞的增殖。RNAseq数据经IPA分析后得出锌指蛋白36（ZFP36）为RIPK3下游效应分子，其相关效应分子包括血管内皮生长因子（VEGF）、人脱帽酶2（DCP2）、脑源性神经营养因子（BDNF）、肿瘤坏死因子（TNF）的转录丰度也发生了相应的变化。结论 RIPK3能够参与对ZFP36以及与其相关效应分子的转录调控，进而在神经系统的发育、炎症和肿瘤发生等生理、病理过程中发挥重要作用。
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RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用
目的 探索受体相互作用蛋白激酶3 (receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)的下游信号通路.方法 向实验组SH-SY5Y细胞内转染pCMV6-RIPK3质粒上调细胞内RIPK3的表达水平,对照组细胞转染相应的空载质粒.通过Western blot检测细胞内RIPK3的表达水平.3-(4,5-甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl),MTT]实验获得2组细胞增殖曲线确定外源性RIPK3在细胞内具有的生物学活性.通过RNAseq检测2组细胞基因转录差异,并在生物通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA)数据库中进行数据分析,获得RIPK3的下游信号通路及其中的关键分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR).采用微滴式数字化PCR(droplet digital PCR,ddPCR)对mTOR转录水平的差异进行验证.结果 质粒DNA整合到细胞基因组内,Western blot提示外源性RIPK3在实验组细胞内稳定表达,MTT结果证明其在细胞内能够抑制细胞增殖.RNAseq及IPA分析结果提示过表达RIPK3能够导致mTOR转录水平发生上调,并对其下游的基因,包括固醇反应结合蛋白(sterol-response binding proteins,SREBPs)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70 ribosomal S6 protein kinases,S6K)、真核生物起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins,4E-BPs)和ULK(unc-51-1ike kinase)激酶复合体的转录具有明显的调节作用.ddPCR实验结果中mTOR表达改变趋势与RNAseq基本一致.结论 RIPK3能够调控mTOR及其下游信号通路中SREBPs、S6K、4E-BPs和ULK基因转录水平,进而在神经系统生长发育和疾病进展中发挥重要作用.
关键词： 神经母细胞瘤 受体相互作用蛋白激酶-3 基因表达调控
