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血管内皮生长因子在强直性脊柱炎活动期病理性表达的临床对照试验
目的:探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在强直性脊柱炎(ankylosing spondyfitis,AS)活动期骶髂关节滑膜的病理性表达及意义.方法:通过原位杂交技术检测活动期AS患者与对照组(骨盆骨折患者)骶髂关节滑膜组织中VEGF的表达,用图像分析系统比较它们的表达差异.结果:在活动期AS患者骶髂关节滑膜组织中VEGF阳性表达,而对照组骶髂关节滑膜组织中VEGF阴性表达.阳性细胞计数及平均灰度值比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF为强直性眷柱炎发病机制中的重要因子,与强直性脊柱炎骶髂关节骨与软骨的破坏及成骨硬化过程密切相关,控制VEGF的表达可能阻断AS的骨质破坏及病理性成骨硬化,为治疗强直性脊柱炎提供新的思路.
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滋阴清热中药对生长延滞中骺板软骨细胞血管内皮生长因子表达的影响
目的:通过检测滋阴清热中药对地塞米松诱导的生长延滞中骺板软骨细胞血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨滋阴清热中药拮抗地塞米松诱导的生长延滞机制.方法:1月龄新西兰免30只,随机分为3组:正常对照组、地塞米松组和中药治疗组,每组10只.地塞米松组和中药治疗组给予地塞米松5mg/kg,每天肌肉给药.中药治疗组给予混有滋阴清热中药的颗粒饲料,正常组及地塞米松组均给予普通饲料,分别在给药第6、12周时处死.TUNEL染色法检测细胞凋亡指数.免疫组织化学染色测定生长板软骨细胞中VEGF表达的阳性指数,实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA在各组的表达.结果:6、12周地塞米松组软骨细胞凋亡指数大于正常组,差异有统计学意叉(P<0.01).6、12周中药治疗组软骨细胞凋亡指数小于地塞米松组,差异有统计学意义(P<0.01).6、12周地塞米松组VEGF的阳性指数、VEGF mRNA表达水平明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01),中药治疗组VEGF阳性指数、VEGF mRNA表达水平明显高于地塞米松组,差异有统计学意义(P<0.01).结论:滋阴清热中药可减少因长期大荆量使用糖皮质激素导致的软骨细胞凋亡;滋阴清热中药可能是通过调控生长板软骨细胞中VEGF而减轻地塞米松对生长板的抑制作用.
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结缔组织生长因子促进半月板无血管区损伤愈合
目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）对纤维软骨细胞外基质分泌、VEGF表达及促进半月板无血管区的损伤修复中的作用。方法：将新西兰大白兔半月板白区，经胶原酶消化、离心分离后，提取半月板纤维软骨细胞，培养至第2代。用流式细胞仪鉴定该细胞表面CD31，CD44，CD45和CD105标志物，并用Ⅱ型胶原抗体做免疫细胞化学鉴定，以证明所培养、传代的细胞是纤维软骨细胞。分别将细胞培养在浓度100 ng/ml的CTGF培养基中3、14 d后，通过实时定量聚合酶链反应，检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF基因的表达变化情况。造模，在兔半月板中央区，制作长3 mm的纵行撕裂。将45只大白兔随机分为3组，处理方式为：半月板单纯缝合术，缝合术加填充PBS-纤维蛋白胶，缝合术加填充1．5滋g CTGF-纤维蛋白胶。术后第1、4、10周用荧光免疫组织化学分析法显示Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF在损伤处的表达与分布情况，直观撕裂处的愈合情况。结果：体外实验第14天，定量RT-PCR结果显示，100 ng/ml CTGF组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF mRNA表达比PBS对照组，明显增加。体内实验的荧光免疫组织化学结果显示，在术后第10周，CTGF治疗组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF已完全填充撕裂损伤处。 PBS-蛋白胶组中，损伤处仍有明显裂隙。结论：CTGF可促进半月板无血管区重要的细胞外基质（Ⅰ型、Ⅱ型胶原）的合成，同时损伤处VEGF的表达活性明显增强，有利于促进无血管区半月板撕裂损伤的愈合。
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中医骨折三期治疗对家兔骨折骨膜组织中VEGF及VEGF mRNA表达的影响
目的:研究中医骨折三期治则对家兔桡骨骨折愈合过程中内外骨膜及骨髓组织VEGF及VEGF mRNA表达的影响,探讨中药治疗骨折的分期治疗的合理性.方法:140只雄性新西兰白兔,无菌状态下手术,在家兔双侧桡骨下1/3段,造成3 mm完全骨质缺损的骨折愈合模型.采用计算机产生随机数字的方法,将家兔随机均分为4组:中药三期治疗组、中药一期治疗组、阳性药物时照组以及模型对照组,分别给予三期治疗、一期治疗、阳性药物治疗以及等量蒸馏水.于术后3、6、9、14、28、42、56d每组随机处死5只家兔,取左侧桡骨标本作为观察对象,采用免疫组化和原位杂交方法检查外骨膜、内骨膜和骨髓组织中VEGF及VEGF mRNA表达,通过图像分析测量各种组织中VEGF及VEGF mRNA表达强度.结果:各中药治疗组对于术后骨折端外骨膜、内骨膜和骨髓组织VEGF和VEGF mRNA表达均有促进作用,三期治疗组有高于其他三组的趋势(P<0.05).结论:中药分期治疗对骨折愈合过程中外骨膜、内骨膜和骨髓组织VEGF及VEGF mRNA表达的促进作用更加明显,骨折分期治疗是必要的.
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活血化瘀中药联合血管内皮生长因子基因转移促进股骨头坏死处新生血管形成的实验研究
目的:观察活血化瘀中药联合血管内皮生长因子(VEGF)基因转移对促进股骨头缺血坏死处新生血管形成情况.方法:日本大耳兔40只,随机分为对照组、模型组、中药组、基因组和综合组.治疗8周后采用免疫组织化学方法观察股骨头滑膜VEGF阳性细胞率及数字减影血管造影股骨头血管数目改变情况.结果:模型组VEGF阳性细胞表达率减低,与对照组、基因组、综合组比较,差异有显著性意义(P＜0.01),与中药组比较,有统计学差异(P＜0.05),综合组VEGF阳性细胞表达率较高,与中药组及基因组比较,有统计学差异(P＜0.05).血管数目:在A区,各组与模型组比较,均无统计学差异;在B区,各组较模型组血管数目均有增加,对照组、基因组、综合组与模型组比较,有统计学差异(P＜0.05).综合组与基因组比较有统计学差异(P＜0.05),中药组虽然血管数目较模型组多,但是无统计学意义.结论:活血化瘀中药及VEGF基因转移均可促进股骨头缺血坏死处局部新生血管形成和侧支循环的建立,尤以活血化瘀中药联合基因疗法效果为好,为临床应用活血化瘀中药联合基因疗法治疗股骨头缺血性坏死提供实验依据.
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活血化瘀中药对激素性股骨头缺血坏死血管内皮生长因子表达的影响
目的:通过观察活血化瘀中药对激素性股骨头缺血坏死血管内皮生长因子(VEGF)的表达,探讨活血化瘀法防治激素性股骨头缺血坏死的作用机制.方法:30只成年新西兰大白兔采用抽签法随机分为2组,正常对照组5只和激素造模组25只.激素造模组每周2次臀肌注射7.5 mg/kg醋酸氢化泼尼松,6周后从激素造模组中抽签随机抽取5只与正常对照组5只同时处死,观察组织病理学变化和VEGF表达.再将其余激素造模组动物(20只)采用抽签法随机分为治疗1、2组与对照1、2组,每组5只.治疗1、2组用桃红四物汤(当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、生地)7 ml/kg灌胃,每天1次,对照1、2组等量生理盐水灌胃.于10周后处死治疗1组和对照1组动物,13周后处死治疗2组和对照2组动物,检测VEGF表达.结果:造模后VEGF的表达明显增加,与正常对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01),但随时间推移,其表达越来越弱.与治疗组比较对照组的VEGF表达明显减弱,有统计学差异(P＜0.001).结论:活血化瘀中药间接地促进了VEGF的表达,可以有效地改善股骨头微循环障碍.
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佐剂关节炎大鼠滑膜血管新生与PTEN/PI3K/AKT信号传导通路的关系
目的:观察佐剂关节炎大鼠滑膜PTEN/PI3K/AKT通路及缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达,探讨类风湿关节炎血管新生的机制.方法:30只大鼠随机分成正常对照组和模型对照组,模型对照组采用弗氏完全佐剂建立佐剂关节炎大鼠模型.造模成功后第19天,采用酶联免疫吸附法检测大鼠HIF-1α、VEGF、微血管密度(MVD)的表达,采用Western Blotting检测滑膜PTEN、PI3K、AKT蛋白表达.结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数升高,血清MVD、VEGF、HIF-1α表达及滑膜PI3K、AKT升高,PTEN降低.相关性分析显示,PI3K、HIF-1α与MVD呈正相关,VEGF、AKT与足趾肿胀度呈正相关,PTEN与关节炎指数呈负相关.HIF-1α与VEGF呈正相关,PI3K与AKT呈正相关,PTEN与PI3K、AKT、VEGF呈负相关.结论:佐剂关节炎大鼠滑膜PTEN/PI3K/AKT通路表达失调是引起滑膜血管新生的机制之一.
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苦碟子注射液对大鼠随意皮瓣存活的影响
目的：观察苦碟子注射液研究苦碟子注射液对大鼠随意型皮瓣存活的影响对大鼠随意皮瓣成活的影响。方法：将2～3月龄重SD大鼠24只，采用随机抽签法分为2组（实验组和对照组，每组12只）。采用改良的大鼠随意型皮瓣制作方法造模，实验组每天腹腔注射苦碟子注射液5 ml/kg ，对照组每天腹腔注射生理盐水5 ml/kg。术后第7天颈椎脱臼处死大鼠分别进行皮瓣存活面积比的检测，同时取皮瓣近中远端组织经组织染色切片后光镜下观察，免疫组化法检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果：术后7 d，实验组皮瓣存活面积比为（70．432±3．867）％，显著高于对照组的（50．498±2．346）％（P＜0．01）；实验组皮瓣组织水肿、炎症细胞浸润情况比对照组明显减轻；切片观察出现较多新生血管，Ⅱ区新生血管密度（（30．11±5．53）/mm2，与对照组（20．13±4．11））/mm2比较，差异有统计学意义（P＜0．01），Ⅲ区坏死严重。实验组VEGF表达量为（4867．31±452．36），与对照组的VEGF表达量（2387．45±768．46）比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论：苦碟子注射液可以提高VEGF的表达量、促进毛细血管新生，减轻皮瓣炎性浸润，还可以明显提高大鼠随意型皮瓣的成活率，为临床皮瓣移植研究提供了新的思路。
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针刺对胚胎着床障碍大鼠黄体功能的影响
目的:观察针刺对胚胎着床障碍大鼠黄体功能的影响,探讨其作用机制.方法:将早孕大鼠随机分为正常组(N)、模型组(M)、针刺穴位组(A)、针刺非穴位组(AC),M组、A组、AC组均采用米非司酮造模.A组针刺大鼠双侧"后三里""三阴交",AC组针刺其穴位旁开非穴位点.放免法检测各组大鼠血清黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)、孕酮(P)的水平;免疫组化、Western-blot方法检测各组大鼠卵巢组织血管内皮生长因子(VEGF)的表达;RT-PCR方法检测各组卵巢组织黄体生成素受体(LHR)mRNA及VEGF mRNA的表达.结果:A组血清LH、P水平显著高于M组、AC组(均P<0.05),与N组比较差异无统计学意义;A组卵巢组织VEGF含量、LHR mRNA、VEGF mRNA表达水平较M组、AC组显著提高(均P<0.05),与N组比较差异无统计学意义.结论:针刺"后三里""三阴交"可升高胚胎着床障碍大鼠血清P、LH水平,上调卵巢组织LHR mRNA、VEGF及其mRNA表达水平,可在一定程度上增强大鼠黄体功能,改善胚胎着床环境.
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输卵管妊娠患者血清VEGF的水平与磁共振成像表现的关系
目的 对比输卵管妊娠患者与早期宫内妊娠孕妇血清VEGF的浓度,以及输卵管妊娠患者的磁共振成像(MRI)表现与其VEGF水平的关系.方法 随机收集2010年1月至2011年6月在本院妇科门诊和住院诊断并经手术病理证实的输卵管妊娠的患者31例[停经时间(40.5±7.1)d],以及因诊断早孕准备行人工流产术的正常宫内妊娠30例[停经时间(37.9±6.4)d].两组研究对象均于确诊妊娠后第2天空腹取肘静脉血,使用ELISA法检测血清中的VEGF水平.31例输卵管妊娠患者则于术前行盆腔平扫和增强MRI检查,分析患者的MRI表现与其VEGF水平的关系.结果 输卵管妊娠患者血清VEGF浓度明显高于早期宫内妊娠的孕妇[(289.2±45.3) ng/L比(19.1±6.3)ng/L,P＜0.05].输卵管妊娠患者囊胚大小、出血、强化程度和宫腔蜕膜化积液均与血清VEGF浓度有关(均P＜0.05),而妊娠部位、盆腔积液与血清VEGF浓度无关(均P＞0.05).结论 输卵管妊娠患者血清VEGF浓度显著高于早期宫内妊娠者,并可能影响囊胚的大小、强化程度、出血和宫腔蜕膜化积液.
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广州地区CYP2C19基因多态性及抗血小板药治疗下血管内皮相关因子水平研究
目的：调查广州地区汉族人群与氯吡格雷代谢相关的细胞色素P4502C19（CYP2C19）基因多态性分布特征，并探讨常规剂量氯吡格雷对不同CYP2C19基因型心脑血管患者血管内皮相关因子影响。方法选取本院行CYP2C19基因多态性检测的无亲缘关系的汉族人群1079例为研究对象，采用基因芯片法检测CYP2C19基因位点CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3，分析基因型频率和等位基因频率，并根据不同的等位基因分成快代谢型、中代谢型、慢代谢型。随机从快代谢型中选取患心脑血管疾病并且连续服用氯吡格雷（75 mg/d）抗血小板药超过6个月的患者28例为快代谢组，用同样的方法选取中代谢组26例、慢代谢组26例，慢代谢型中选取服用氯吡格雷（75 mg/d）+阿司匹林（100 mg/d）联合用药患者13例为慢代谢联合用药组，选取患有心脑血管疾病没服用任何抗血小板药的患者27例作为对照组，检测各组患者血浆中血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞间黏附分子（VCAM?1）水平。结果广州地区汉族人群CYP2C19基因型以野生型为主，CYP2C19*1*1频率为41.97%， CYP2C19*1*2频率为39.85%，CYP2C19*1*3频率为5.65%，CYP2C19*2*2频率为9.08%，CYP2C19*2*3频率为3.05%，CYP2C19*3*3频率为0.58%，CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*33种等位基因的发生频率分别为64.55%、30.53%和4.92%；CYP2C19代谢表型以中间代谢型为主（45.50%），其次是快代谢型（41.79%），慢代谢型（12.71%）低。快、中、慢代谢组、对照组组间VEGF、VCAM?1水平比较有增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。慢代谢氯吡格雷组与慢代谢联合用药组VEGF、VCAM?1水平比较，无统计学差异（P>0.05）。结论广州地区汉族人群CYP2C19代谢表型以中间代谢型为主，其次是快代谢型，慢代谢型低，服用常规剂量氯吡格雷联合阿司匹林对改善血管内皮相关因子并不优于单用氯吡格雷。
关键词： 细胞色素P450酶系统 血管内皮生长因子类 多态性 单核苷酸 血管内皮相关因子 -
缺氧状态下体外培养成骨细胞血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达及意义
目的 研究缺氧对体外培养成骨细胞血管内皮生长因子(VEGF) 和骨形态发生蛋白 2 (BMP-2)表达的影响及意义.方法 采用酶消化法获取人成骨细胞并进行原代培养,倒置显微镜下观察成骨细胞的生长形态;采用 Gomori 改良钙钴法和免疫组织化学 SABC 法分别检测原代培养成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP) 和骨钙素 (OCN) 的表达,进行原代培养成骨细胞鉴定.细胞传至第 2 代时,按继续培养条件的不同将细胞分为缺氧组 (氧分压＜4.8 kPa、氧容积比＜5%)和常氧组,在传代培养 24、48、72h 时分别收集 2 组细胞,采用免疫组织化学 SABC 法检测 VEGF 和 BMP-2的表达,应用图像分析系统进行半定量检测,结果 以平均灰度值表示,平均灰度值低示表达水平高.结果 原代培养成骨细胞可表达 ALP 和 OCN,初步确定经体外培养获得了具有生物活性的成骨细胞.在培养 24、48、72h 时,缺氧组成骨细胞 VEGF 表达水平均明显高于常氧组 (平均灰度值分别为123.53±7.38 vs 141.21±6.03、116.45±6.34 vs 138.37±5.04、108.11±5.37 vs 136.65±6.54,均 P＜0.01),且缺氧组成骨细胞 VEGF 表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高.缺氧组成骨细胞 BMP-2 表达水平在培养 24h 时明显高于常氧组 (平均灰度值为143.28±.2.82 vs 146.91±2.06,P＜0.01),而在培养 48、72h 时与常氧组比较,差异均无统计学意义.结论 缺氧可诱导成骨细胞 VEGF 的表达上调;而缺氧延长则不利于成骨细胞 BMP-2 的表达.缺氧对 VEGF 和BMP 的早期表达调控可能与骨修复的启动相关.
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血管内皮生长因子作为结直肠癌新生血管标志的临床价值
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)在结直肠癌组织中的表达及其作为肿瘤新生血管标志的临床价值.方法 采用免疫人VEGF单克隆抗体及鼠抗人因子Ⅷ相关抗原(F-8 RAg)单克隆抗体,通过免疫组化技术对48例结直肠癌手术切除的癌组织及癌旁正常组织(对照组织)中VEGF和F-8 RAg的表达进行检测.结果 结直肠癌组织VEGF表达阳性率为62.5%(30/48),对照组为16.7%(8/48),x2=64.352,P＜0.01.结直肠癌组织F-8 RAg标记的MVD为100.9±16.0,对照组为46.8±11.9,t=18.351,P＜0.01.VEGF的表达与大肠癌的淋巴结转移(P＜0.01)、远处转移(P＜0.05)及临床分期有关(P=0.01);而F-8 RAg标记的MVD与大肠癌的淋巴结转移、远处转移及临床分期无明显相关(P＞0.05).VEGF在结肠癌组织的表达与F-8 RAg的表达无相关性(P＞0.05).结论 VEGF在结直肠癌组织新生血管有良好表达,可以作为结直肠癌新生血管有价值的标志.
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抗VEGF单克隆抗体生物学活性分析方法的建立及其应用
目的：建立抗 VEGF单克隆抗体生物学活性分析方法，并对实验条件进行优化及方法学验证。方法从新生儿脐带分离获取人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用第4~6代细胞进行活性检测。HUVEC接种96孔板于 CO2培养箱培养4 h后加入不同浓度的抗 VEGF单克隆抗体——VEGF165混合物孵育48 h，加入 CCK8显色4 h，酶标仪读取各孔OD450吸光值，采用四参数拟合绘制标准曲线，计算参比品和样品的 IC50值，获取样品的相对活性。结果该方法专属性强，仅在抗 VEGF单克隆抗体上呈现相应的剂量关系曲线，标准曲线拟合度r2>0.99，精密度样品相对活性RSD <20%，方法在50%~200%活性范围内具有良好的准确性。用该方法对两个候选药分别进行6次重复性检测，候选药相对活性值分别为（95.80±3.29）%，（101.10±3.81）%。结论本研究建立的 HUVEC增殖抑制法特异性高、重复性好，并具有良好的准确性及精密度，可用于抗 VEGF单克隆抗体生物学活性的评估。
关键词： 人脐静脉内皮细胞 血管内皮生长因子类 抗 VEGF单克隆抗体 -
Versican在胃癌中的表达及其临床意义
目的 探讨Versican在胃癌组织中的表达及其与胃癌血管生成的关系.方法 用免疫组织化学EliVision方法检测80例患者胃癌组织和30例患者癌旁正常组织中Versican和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,CD34标记胃癌的微血管密度(MVD).结果 (1)胃癌组织中的Versican、VEGF和MVD均显著高于正常胃黏膜(P＜0.05).(2)在胃癌中Versican主要表达于间质纤维母细胞的胞质,且其表达与胃癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移相关(P＜0.05),VEGF主要表达于癌细胞的胞质,且与胃癌的分化程度、临床分期、Lauren分型及淋巴结转移显著相关(P＜0.05).(3)胃癌组织中的MVD与分化程度、临床分期、Lauren分型、浸润深度及淋巴结转移显著相关(P＜0.05).(4)在胃癌组织中Versican与VEGF的表达呈正相关(r=0.467,P＜0.01).结论 Versican和VEGF的表达与胃癌的血管生成关系密切,二者协同作用促进胃癌的血管生成.
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肾上腺皮质癌、腺瘤临床病理特征分析和表皮生长因子受体、血管内皮生长因子的表达及意义
目的 探讨肾上腺皮质癌、腺瘤临床病理特征及表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达及意义.方法 选取2001年7月至2010年7月在北京协和医院经手术治疗且具有完整的临床、病理资料的肾上腺皮质肿瘤存档石蜡标本42例,其中肾上腺皮质腺瘤(ACC)、肾上腺皮质癌(ACA)各21例,对临床资料进行回顾性分析,采用WEISS系统评分,免疫组织化学检测二者EGFR和VEGF的表达情况,并进行随访.结果 (1)临床特点:9例表现为原发性醛固酮综合征,其中8例良性,1例恶性.ACC肿瘤平均直径11.7 cm,病程8.5个月,ACA肿瘤平均直径3.0 cm,病程为45.6个月.(2)病理特点:ACA患者WEISS得分全部≤2分,平均0.9分；ACC患者得分＞4分,平均6.6分.窦隙浸润与转移有一定相关性(P＜0.01).(3)免疫组织化学:ACC中,EGFR阳性率61.9％ (13/21),而ACA中除5例呈1+、1例呈2+外,其余均为阴性,两者表达差异有统计学意义(P=0.030).ACC中,VEGF阳性率为71.4％ (15/21),其中3+占28.6％ (6/21)；2+占28.6％(6/21)；ACA中,只有3例呈2+,4例呈1+,其余全部为阴性,两者表达差异有统计学意义(P=0.013).且VEGF强阳性(3+)与静脉浸润相关(P =0.028).(4)生存分析:随访到的16例ACC患者,其肿瘤的质量与预后有一定的相关性(P=0.468).结论 肿瘤的大小、质量、内分泌特征在提示良恶性方面有重要意义.WEISS得分≥3分诊断肾上腺皮质癌效能很高,且窦隙状结构浸润与转移关系密切.EGFR、VEGF表达对肾上腺皮质癌和腺瘤有重要鉴别诊断价值.
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大鼠脑缺血后血管内皮生长因子和血管生成素的表达变化及其作用
目的 探讨大鼠脑缺血后血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(angiopoietin,Ang)的表达变化及其在血管生成和血管通透性变化中的作用.方法 选择160只雄性SD大鼠,采用随机区组法分为假手术组,缺血2h、6h、12h、1d、3d、7d和14d组,用线栓法制作大脑中动脉阻塞脑缺血损伤模型,分别于脑缺血后不同时间点处死大鼠.通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot及免疫组织化学方法检测大鼠脑缺血后不同时间点VEGF、Ang-1及Ang-2 mRNA和蛋白的表达变化.CD31标记鼠脑缺血后不同时间点的血管数量.Evans blue检测血脑屏障通透性.结果 大鼠脑缺血后VEGF mRNA表达逐渐增高,12 h达第一个高峰(0.7249 ±0.1933,P＜0.01),7d达第二个高峰(0.5264±0.1519,P＜0.01)；VEGF蛋白表达也逐渐增高,于12 h达高峰(1.1017±0.1302,P＜0.01).Ang-2 mRNA和蛋白在脑缺血组织也逐渐增高,均12 h达高峰(0.6747±0.2416,P＜0.01；1.1197±0.1780,P＜0.01).与之相反,Ang-1 mRNA和蛋白表达逐渐降低,分别于3 d(0.3220±0.1427,P＜0.01)和1 d(0.1298±0.0293,P＜0.01)达低水平,这些因子在脑缺血后的表达促进血管生成.脑缺血后血管通透性逐渐增加,EB含量在缺血1d达高峰[(6.219±0.887) μg/g,P＜0.01].结论 大鼠脑缺血后VEGF、Ang-1和Ang-2共同协调作用促进血管生成,在组织损伤修复过程中发挥着重要的作用.
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靶向血管内皮生长因子C短发夹式RNA对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响
目的 研究重组质粒表达载体介导的短发夹式RNA(shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞株中血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达及乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株,嘌呤酶素筛选阳性克隆;荧光定量PCR及Western blot检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C基因的表达;MTT法及Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭能力.结果 转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05);MTT法和 Transwell体外侵袭实验显示,与阴性质粒组和空白对照组比较,转染重组质粒后各时间段乳腺癌MCF-7细胞增殖均明显受抑制(P<0.05),同时穿膜的肿瘤细胞数也明显减少[(29.0±1.9)个与(59.0±2.1)个和(61.0±2.2)个相比,P<0.05].结论 表达VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C在乳腺癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用,并对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力有显著抑制作用.
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缺氧反应元件启动子-反义血管内皮生长因子165 cDNA和单纯疱疹病毒1-胸苷激酶基因共表达治疗骨肉瘤的体外研究
目的 探讨缺氧条件下,转基因细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达变化以及单纯疱疹病毒1-胸苷激酶(HSV1-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统对转基因细胞的特异杀伤作用.方法 以缺氧诱导因子-1/缺氧反应元件(HIF-1/HRE)基因调节系统为载体,采用DNA重组技术构建由HRE启动子驱动的含人反义VEGF165cDNA全长和HSV1-TK基因的真核表达质粒,将其稳定转染人骨肉瘤细胞系MG63.应用PCR和RT-PCR方法检测TK基因的整合及转录;用MTY法和混合共培养实验分别检测转基因细胞在缺氧或不缺氧条件下对GCV的敏感性以及HSV1-TK/GCV系统的"旁观者效应";ELISA法检测细胞在缺氧条件下VEGF表达变化;流式细胞仪检测细胞周期改变及电镜观察细胞超微结构变化.结果 成功构建了由HRE启动子驱动的含反义VEGF165 cDNA全长和潮霉素磷酸转移酶-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HyTK)基因的真核表达质粒pBI-HRE-AsVEGF165-HyTK;得到转基因细胞系MG63TV;检测到MG63TV细胞内TK基因的DNA和mRNA.缺氧条件下,转基因细胞存活率与GCV浓度呈现剂量依赖性,对GCV的敏感性提高了100倍;HSV1-TK/GCV系统旁观者效应明显增强;肿瘤细胞VEGF分泌下降50%.缺氧和GCV共同作用使转基因细胞DNA合成抑制,细胞周期阻滞于G0～G1期,细胞发生凋亡和坏死.结论 利用肿瘤缺氧,HRE启动子能够实现反义VEGF165对体外培养的肿瘤细胞VEGF表达的靶向性抑制作用,并能增强HSV1-TK/GCV系统对肿瘤细胞的特异性杀伤作用和旁观者效应.该双基因共表达载体系统为实践联合抗血管生成和自杀基因治疗骨肉瘤提供了实验依据.
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PTEN基因对胃癌细胞株SGC7901生物学行为及血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶2及9表达的影响
目的 探讨PTEN基因对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制.方法 脂质体转染并经免疫细胞化学、Western blot鉴定得到稳定高表达PTEN蛋白的SGC7901细胞克隆;细胞倍增时间测定、平板克隆形成试验及流式细胞术分析转染前后细胞增殖能力及细胞周期与凋亡率的变化;应用ELISA法、明胶酶谱分析、免疫细胞化学及Western blot等技术分别检测转染前后细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-9与MMP-2蛋白的分泌与表达.结果 成功地建立了稳定高表达PTEN蛋白的SGC7901细胞模型.PTEN-SGC7901细胞(PTEN基因转染细胞组)的倍增时间较SGC7901(未转染细胞组)、PBP-SGC7901细胞(空白质粒转染细胞组)显著延长(P＜0.05).PTEN-SGC7901细胞的克隆形成率明显低于对照组,PTEN-SGC7901细胞对SGC7901、PBP-SGC7901细胞的集落抑制率分别为69.8%、64.8%.PTEN-SGC7901组细胞的G1期细胞含量明显较对照组增多(P＜0.05),但三组细胞之间的凋亡率无明显差别(P＞0.05).PTEN-SGC7901细胞VEGF与MMP-9蛋白的表达和分泌明显低于对照组(P＜0.05),但MMP-2蛋白在三组间的表达无差异(P＞0.05).结论 PTEN可抑制胃癌细胞株SGC7901细胞的生长与增殖;PTEN可能通过下调SGC7901细胞株VEGF及MMP-9的表达与分泌来抑制肿瘤浸润与转移的发生.
