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结缔组织生长因子促进半月板无血管区损伤愈合
目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）对纤维软骨细胞外基质分泌、VEGF表达及促进半月板无血管区的损伤修复中的作用。方法：将新西兰大白兔半月板白区，经胶原酶消化、离心分离后，提取半月板纤维软骨细胞，培养至第2代。用流式细胞仪鉴定该细胞表面CD31，CD44，CD45和CD105标志物，并用Ⅱ型胶原抗体做免疫细胞化学鉴定，以证明所培养、传代的细胞是纤维软骨细胞。分别将细胞培养在浓度100 ng/ml的CTGF培养基中3、14 d后，通过实时定量聚合酶链反应，检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF基因的表达变化情况。造模，在兔半月板中央区，制作长3 mm的纵行撕裂。将45只大白兔随机分为3组，处理方式为：半月板单纯缝合术，缝合术加填充PBS-纤维蛋白胶，缝合术加填充1．5滋g CTGF-纤维蛋白胶。术后第1、4、10周用荧光免疫组织化学分析法显示Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF在损伤处的表达与分布情况，直观撕裂处的愈合情况。结果：体外实验第14天，定量RT-PCR结果显示，100 ng/ml CTGF组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF mRNA表达比PBS对照组，明显增加。体内实验的荧光免疫组织化学结果显示，在术后第10周，CTGF治疗组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF已完全填充撕裂损伤处。 PBS-蛋白胶组中，损伤处仍有明显裂隙。结论：CTGF可促进半月板无血管区重要的细胞外基质（Ⅰ型、Ⅱ型胶原）的合成，同时损伤处VEGF的表达活性明显增强，有利于促进无血管区半月板撕裂损伤的愈合。
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脱细胞半月板细胞外基质对半月板细胞的影响
目的探讨脱细胞半月板细胞外基质（dMECM）对传代半月板细胞增殖、细胞活性以及细胞表型的影响。
方法用 CCK-8法检测 dMECM 对半月板细胞增殖的影响；将 P3代的内侧半月板纤维软骨细胞种植在 dMECM修饰盖玻片上，以未修饰盖玻片为对照，体外培养7、14 d后进行细胞活性检测，糖胺多糖、胶原分泌含量测定并用RT-PCR 检测半月板细胞特异性基因 mRNA 表达变化。
结果 CCK-8结果证实，与对照组比较，生长在 dMECM修饰盖玻片上的 P3代兔半月板纤维软骨细胞具有更好的细胞增殖特性（P<0.05）；细胞死/活染色结果证实 dMECM组可维持更好的细胞活性；糖胺多糖和胶原定量检测结果证实 dMECM 组在第7、14天时，比对照组分泌更多的糖胺多糖和胶原（P<0.05）。RT-PCR 的检测结果证实体外培养7、14 d 时，dMECM 组 II 型胶原 mRNA 表达显著上调（P<0.05）。
结论 dMECM 可以很好地促进半月板纤维软骨细胞的增殖、分化以及细胞活性的维持，可能是未来半月板组织工程领域非常有前景的支架材料之一。 -
Ihh和PTHrP信号分子在猪跟腱止点的表达及意义
目的 观察猪跟腱止点各层组织结构特点及Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、X型胶原(Col X)、纤维软骨层细胞外基质以及印度豪猪蛋白(Ihh)和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)在跟腱止点中的表达分布和定位情况.方法 根据跟腱止点的组织结构层次的不同,利用HE染色、番红O/固绿染色、天狼猩红染色以及免疫组织化学技术,分别观察跟腱止点各层组织结构特点,通过免疫组织化学染色观察Col Ⅰ、ColⅡ、Col X、纤维软骨层细胞外基质以及Ihh和PTHrP在跟腱止点中的表达分布和定位情况.结果 显微镜下可清晰观察到猪跟腱止点解剖层次,主要分为4个层次,波浪状的腱纤维、纤维软骨层(也称非钙化软骨层)、钙化软骨层和骨.跟腱止点组织Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色证实纤维软骨层细胞外基质主要由Col Ⅰ、ColⅡ构成.跟腱止点组织中Ihh和PTHrP免疫组织化学染色呈阳性表现,Ihh和PTHrP阳性区域主要集中在跟腱止点的纤维软骨层和钙化层.同时可以观察到在肥大软骨细胞细胞浆中出现浓聚现象.结论 跟腱止点纤维软骨层由纤维软骨细胞构成,是跟腱止点的重要结构,Ihh和PTHrP在跟腱止点纤维软骨层和钙化层的定位表达,提示两者在跟腱止点的形成过程发挥重要的调节作用.
关键词： 跟腱止点 纤维软骨细胞 印度豪猪蛋白 甲状旁腺激素相关蛋白 免疫组织化学染色 -
基因治疗在运动医学中的应用
基因治疗是人类很多疾病治疗的重大变革,为人类战胜疾病,延长寿命,提供了新的途径. 人类基因治疗领域的发展速度非常迅猛,已由早期针对单基因遗传性疾病的治疗迅速扩展到治疗获得性疾病,而且基因转移还可用作一种药物的传递系统.运动创伤经常涉及一些愈合能力十分有限的组织,例如,关节软骨、韧带、半月板、肌腱等.近研究证明,一些生长因子和细胞因子在愈合过程中起着重要作用,这些分子有望成为治疗运动创伤的新药,但是从临床上讲还没有有效的方法能将它们传入体内.发展基因治疗技术可以通过局部的方法将生物药物传入体内.目前已完成了将标记基因传递到滑膜、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞、腱细胞和韧带成纤维细胞中的实验研究,为基因治疗终在运动医学领域中的临床应用奠定了基础[1,2].
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骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化
背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.
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软骨形态发生蛋白1诱导犬真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的实验研究
目的 探讨软骨形态发生蛋白1 (Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1)诱导体外培养的犬真皮成纤维细胞(Dermal fibroblasts，DFs)向软骨细胞表型分化的可行性。方法应用CDMP1细胞诱导液对体外扩增至第4代的犬DFs进行诱导培养，观察细胞的形态变化，以免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中软骨特异蛋白的表达情况。结果诱导培养6d后，实验组部分DFs呈星形或多角形，免疫组化染色显示有软骨特异的Ⅱ型胶原分泌,RT-PCR检测也表明有Ⅱ型胶原、aggrecan和SOX9表达。但是诱导培养10d后，均转为阴性。结论CDMP1可以诱导犬DFs向软骨细胞表型分化，有可能成为组织工程化纤维软骨的种子细胞。
关键词： 真皮成纤维细胞 纤维软骨细胞 软骨形态发生蛋白-1 组织工程 -
猪跟腱止点纤维软骨细胞的分离、体外培养及鉴定
[目的]探讨猪跟腱止点纤维软骨层细胞的分离、培养及鉴定方法,观察纤维软骨细胞的生物学特性.[方法]体视显微镜下切取贵州迷你小香猪跟腱止点纤维软骨层组织并剪碎,经过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶两步酶消法,后在含10％ FBS的DMEM进行培养和传代,使用HE、阿利新蓝、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定.[结果]成功分离获得纤维软骨细胞.鉴定证实实验细胞具有纤维软骨细胞共同生物学特性.HE染色:细胞浆蛋白多糖成分被染成深浅不同的粉红色;阿利新蓝染色:纤维软骨细胞内见蓝紫色异染颗粒,细胞核深染,细胞周围有少量异染颗粒出现.Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:纤维软骨细胞胞质被染成棕黄色.[结论]成功分离和培养了猪跟腱止点纤维软骨层细胞,针对纤维软骨细胞特性,通过不同染色方法进行了联合鉴定.本实验建立的腱止点纤维软骨细胞分离、培养方法是一种简便可靠的方法.
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丝素-胶原复合物半月板支架负载纤维软骨细胞的实验观察
目的 探讨蚕丝蛋白纤维(丝素)-胶原复合半月板支架作为兔纤维软骨细胞组织工程支架的可行性.方法 构建丝素-胶原复合物半月板支架,将体外培养扩增的兔半月板纤维软骨细胞接种于该支架上,加入转化生长因子(TGF)-β1三维立体培养,倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态.结果 丝素-胶原复合物能制成理想形状和大小的三维立体多孔半月板支架,纤维软骨细胞能良好地贴附于支架孔壁上.结论 丝素-胶原复合物半月板支架细胞相容性良好,是半月板组织工程支架的可选材料.
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半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层相容性的研究
严重的半月板损伤需要进行半月板的移植,防止膝关节的退行性变.我们以猪小肠黏膜下层(SIS)作为支架材料,通过观察兔半月板纤维软骨细胞在此载体中的生长、增殖情况,评价SIS的生物相容性,为应用SIS作为支架材料构建组织工程半月板提供实验依据.
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成纤维细胞生长因子基因转染对纤维软骨细胞特性的影响
半月板是膝关节内的重要结构其损伤后,自行愈合的能力较差,与损伤局部缺乏特异性的生长因子有一定关系[1].我们应用基因治疗技术进行碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的转染,观察半月板纤维软骨细胞对bFGF基因转染的反应.
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透明质酸对体外培养半月板纤维软骨细胞的影响
目的观察体外培养半月板纤维软骨细胞的生长特点及生物学特性,研究中分子量透明质酸(hyaluronic acid, HA)对体外培养半月板纤维软骨细胞的影响.方法机械分离和胰酶、胶原酶联合消化,将兔半月板纤维软骨细胞进行体外分离培养,动态观察细胞形态变化和生长情况.设立对照,观察中分子量透明质酸HA(分子量2×106)对细胞生长增殖的影响,利用同位素标记技术,测定细胞对培养基中 3H-TdR、 3H-Pro和Na35SO4的摄取量,比较细胞DNA、胶原蛋白和蛋白多糖合成的速度.结果体外培养的半月板细胞呈多角形、有突起、富含分泌颗粒.当培养基中加入HA后,细胞 3H-TdR、 3H-Pro和Na35SO4的摄取量不同程度高于对照组,统计学相差显著(P＜0.05).结论中分子量透明质酸能促进体外培养半月板纤维软骨细胞增殖和细胞外基质合成.
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人腱止点软骨细胞的分离培养及形态学特征观察
目的 探讨人膝关节前交叉韧带( anterior cruciate ligament,ACL)腱止点软骨细胞的分离方法,观察软骨细胞的生物学特性.方法 取1例来源于交通事故的健康志愿者膝关节前交叉韧带腱止点标本,胰蛋白酶去除纤维组织后Ⅱ型胶原酶消化,观察细胞形态变化,使用甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型.结果 甲苯胺蓝染色见软骨细胞内蓝紫色异染颗粒,细胞核深染；细胞周围有少量异染颗粒出现.Ⅱ型胶原免疫组化染色:软骨细胞细胞质被染成棕黄色,细胞核不着色,具有软骨细胞共同生物学特性.结论 成功分离提取了腱止点软骨细胞,其形态和生物学特性与关节软骨细胞相似,但细胞密度低于相同方法分离的关节软骨细胞.
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滑膜间充质干细胞成纤维软骨分化条件初步探索
目的 采用正交实验研究滑膜间充质干细胞(synovial derived MSCs,SMSCs)成纤维软骨分化的条件.方法 5只成年新西兰白兔,活检取滑膜组织.贴壁法获取SMSCs后采用流式细胞仪及成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定.根据预实验与文献综述寻找与SMSCs成纤维软骨分化可能相关的条件,采用缺失实验初筛必要条件后,TGF-β1、BMP-2、地塞米松、脯氨酸、柠檬酸(ascorbic acid,ASA)、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液、牛血清白蛋白、bFGF、间断静水压、BMP-7、IGF纳入正交实验,采用SPSS18.0统计软件设计L60 (212)正交实验及表头,定义2水平条件,在SMSCs-三维小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架上诱导成纤维软骨分化.使用流式细胞仪计数,检测CD151+/CD44+细胞并记录SMSCs向纤维软骨分化的转换率,采用免疫组织化学染色,结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原(collagentype Ⅰ,Col Ⅰ)、ColⅡ、ColⅨ基因表达,进一步验证结果.检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与高表达Col Ⅰ细胞的比例乘积.同时采用PicoGreen Assay测量细胞总DNA量,以反映细胞扩增情况.正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法,考虑部分因子间的1阶交互作用,组间差异采用LSD和q检验验证,使用Ⅲ型平方和校正模型,检验水准α=0.05.结果 实验获取的细胞为SMSCs,细胞倍增时间为28 h.成纤维软骨分化过程中SMSCs-三维SIS支架体积5d倍增,14d后得到甲苯胺蓝染色阳性的细胞-支架复合物.正交实验结果直观分析示,TGF-β1对成纤维软骨分化转化率的作用明显,BMP-7采用水平2有利于得到更高的转化率,但与BMP-2存在交互作用;其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有DEX、ASA、ITS、转铁蛋白、bFGF,模型的相关性好.方差分析校正模型P=0.000,能够满足实验设计;截距P=0.000,说明各因子对因变量影响差异不完全相同.TGF-β1、ASA、bFGF、IGF对因变量调控作用较其他因子显著,差异有统计学意义,与直观观察结果相似.结论 TGF-β1、ASA、bFGF、IGF显著影响SMSCs成纤维软骨分化,通过合理调整上述因子浓度,可显著提高SMSCs成纤维软骨分化转化率;精确的调控条件和调控机制有待进一步探索.
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CPPf/PLLA支架负载人半月板纤维软骨细胞的体外实验研究
目的探讨聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPPf/PLLA)支架负载人半月板纤维软骨细胞的有效性和可行性.方法将人半月板纤维软骨细胞接种CPPf/PLLA支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察纤维软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB(甲苯胺蓝)及Ⅰ型胶原免疫组化染色观察纤维软骨组织形成情况.结果纤维软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的纤维软骨组织.结论CPPf/PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为负载人纤维软骨细胞的载体.
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羊膜与人胚半月板细胞构建复合物的实验研究
目的研究羊膜作为半月板组织工程支架材料应用的可行性.方法采用胶原酶阶段消化法获取人胚半月板纤维软骨细胞,取经TGF-β1扩增的第3代细胞与羊膜进行复合培养,进行MTT、光镜、扫描电镜观察.结果纤维软骨细胞于羊膜上牢固粘附,3天开始增殖,2周时已有大量细胞生长于羊膜上.结论羊膜表现出良好的细胞吸附性和体外生物相容性,半月板细胞可在其上粘附、增殖,因此可作为半月板组织工程细胞支架材料.
