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实验性氟中毒骨组织中Ⅱ型胶原基因表达及结构的改变
目的观察过量氟对大鼠骨组织中Ⅱ型胶原基因表达的影响和对大鼠骨骼中胶原类型及胶原结构的作用.方法制备Ⅱ型胶原cDNA探针,采用cDNA-mRNA原位杂交技术,检测饮用过量氟水(氟化钠221 mg/L)的大鼠骨组织中Ⅱ型胶原的改变.采用苦味酸天狼星红染色-偏振光法对骨组织中胶原类型及胶原纤维结构进行观察.结果染氟后,股骨等骨组织出现成软骨细胞.cDNA-mRNA原位杂交显示,软骨化的骨组织软骨陷窝的软骨胞质中可见Ⅱ型胶原基因表达.染氟0.5个月组肋软骨软骨细胞胶原mRNA水平高,其灰度值和标准误分别为0.086和0.013,染氟1个月及2个月后逐渐减弱,其灰度值和标准误分别为0.047、0.008和0.039、0.007.苦味酸天狼星红染色-偏振光法观察骨组织中出现多色性Ⅱ型胶原纤维,胶原纤维断裂、排列紊乱、含量下降.结论过量氟可致骨组织中胶原类型和胶原结构的改变,导致Ⅱ型胶原在软骨化骨组织中的表达及在肋软骨组织中的表达增强.
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结缔组织生长因子促进半月板无血管区损伤愈合
目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）对纤维软骨细胞外基质分泌、VEGF表达及促进半月板无血管区的损伤修复中的作用。方法：将新西兰大白兔半月板白区，经胶原酶消化、离心分离后，提取半月板纤维软骨细胞，培养至第2代。用流式细胞仪鉴定该细胞表面CD31，CD44，CD45和CD105标志物，并用Ⅱ型胶原抗体做免疫细胞化学鉴定，以证明所培养、传代的细胞是纤维软骨细胞。分别将细胞培养在浓度100 ng/ml的CTGF培养基中3、14 d后，通过实时定量聚合酶链反应，检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF基因的表达变化情况。造模，在兔半月板中央区，制作长3 mm的纵行撕裂。将45只大白兔随机分为3组，处理方式为：半月板单纯缝合术，缝合术加填充PBS-纤维蛋白胶，缝合术加填充1．5滋g CTGF-纤维蛋白胶。术后第1、4、10周用荧光免疫组织化学分析法显示Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF在损伤处的表达与分布情况，直观撕裂处的愈合情况。结果：体外实验第14天，定量RT-PCR结果显示，100 ng/ml CTGF组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF mRNA表达比PBS对照组，明显增加。体内实验的荧光免疫组织化学结果显示，在术后第10周，CTGF治疗组中的Ⅰ型、Ⅱ型胶原和VEGF已完全填充撕裂损伤处。 PBS-蛋白胶组中，损伤处仍有明显裂隙。结论：CTGF可促进半月板无血管区重要的细胞外基质（Ⅰ型、Ⅱ型胶原）的合成，同时损伤处VEGF的表达活性明显增强，有利于促进无血管区半月板撕裂损伤的愈合。
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鹿茸多肽对实验性膝骨性关节炎关节软骨中糖胺多糖和Ⅱ型胶原水平的影响
目的:检测膝骨性关节炎关节软骨中糖胺多糖和Ⅱ型胶原的水平及鹿茸多肽对其影响.方法:6月龄新西兰大白兔64只,随机分为正常组(8只)和模型组(56只).模型组采用Hulth法造成膝骨性关节炎模型.造模成功后再将模型组随机分为鹿茸多肽组(24只)和对照组(24只),鹿茸多肽组给予鹿茸多肽稀释液0.5 ml,每2日1次关节腔注射；对照组给予0.5 ml生理盐水,每2日1次关节腔注射.分别于干预后第7、15、30天分3批取材,甲苯胺蓝染色观察两组关节软骨中糖胺多糖含量,免疫组织化学法观察软骨基质中Ⅱ型胶原的表达.结果:随着干预时间的延长,鹿茸多肽组和对照组软骨基质中糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达量逐渐减少.鹿茸多肽组药物干预后第7、15、30天,Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值分别为(312.06±14.12)、(273.31±12.42)和(248.34±10.41),组间差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组干预后第7、15、30天,Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值分别为(253.47±15.53)、(215.67±9.72)和(160.01±13.23),组间差异有统计学意义(P＜0.05).相同时间段内,鹿茸多肽组Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值高于对照组,组间差异有统计学意义.结论:鹿茸多肽通过阻止膝骨性关节炎关节软骨基质中糖胺多糖和Ⅱ型胶原含量的减少,一定程度上廷缓关节软骨的退变.
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尼古丁对兔骨髓基质干细胞增殖及向软骨细胞方向分化的影响
目的:探讨不同浓度尼古丁对单层培养的骨髓基质干细胞及向软骨方向分化的影响.方法:获取兔骨髓基质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态.取第3代细胞,加入不同浓度(0、1×10-7、1×10-6、1×10-5M)的尼古丁,分别于1、4、7、14d用MTT法检测其对骨髓基质干细胞增殖的影响.取第3代细胞进行诱导分化,用逆转录聚合酶链式反应(RT- PCR)法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.结果:镜下见细胞形态由圆形向梭形转化；1×10-7、1×10-6M尼古丁浓度能够促进骨髓基质干细胞的增殖,1×10-5M尼古丁则会抑制骨髓基质干细胞的增殖活性.1×10-7、1×10-6M(特别是1×10-6M)的尼古丁能够增加诱导后Ⅱ型胶原的表达,并随时间延长而增加.而1×10-7M尼古丁在第7天时能促进诱导后蛋白聚糖的表达,1×10-5M尼古丁则能抑制Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA表达.结论:低浓度的尼古丁能够促进骨髓基质干细胞的增殖及向软骨细胞方向分化,高浓度的尼古丁则对其有抑制作用,由此推测在软骨组织工程中,局部适时适量的应用尼古丁是一种能够促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化的有前景的治疗方法.
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骨关节炎早期的Ⅱ型胶原代谢产物
骨关节炎是以关节软骨渐进性破坏为特点的、普遍的致残性疾病.临床上需要一些早期即可以测量的、敏感的、特异性的标志物来诊断疾病.软骨的主要组成是Ⅱ型胶原,所以其合成和降解所产生的生物学标志物已成为研究重点.对关节滑液、血清、尿中的生物学标志物的检测可以早期诊断疾病、监测疾病的发展、了解机体对治疗药物的反应.Ⅱ型胶原合成的产物包括:Ⅱ型胶原C前肽、ⅡA型胶原N前肽.Ⅱ型胶原降解产物包括:Ⅱ型胶原C端肽、Ⅱ型胶原新抗原表位、Ⅱ型螺旋、单克隆抗体C2C结合肽段、可氰溴化的9.7肽段、Ⅱ型胶原-1和硝化的Ⅱ型胶原-1.本文仅对Ⅱ型胶原合成、降解所产生的生物学标志物与早期骨关节炎之间的关系加以阐述.
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Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定
目的 制备Ⅱ型胶原C端肽中EKGPDP多肽片段(谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸)的单克隆抗体(McAb),并进行抗体的纯化、鉴定及初步临床验证.方法 采用戊二醛法制备EKGPDP-钥孔嘁血蓝素(key hole limpet hemocyanin,KLH)抗原载体复合物.腹腔及静脉攻击法免疫BALB/c小鼠8只.按常规方法将小鼠骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合.筛选阳性克隆株,以有限稀释法克隆3次.对杂交瘤细胞株的染色体、亲和力、类型和稳定性进行鉴定,取其中亲和力较高的6株制备腹腔积液,用盐析及蛋白G琼脂糖凝胶珠层析法纯化抗体.对McAb的纯度、特异性、交叉反应性及免疫活性进行鉴定.用免疫组化法对骨性关节炎膝关节软骨和椎间盘软骨样品进行分析.结果 本研究获得13株能高效分泌特异性McAb的杂交瘤细胞株;经5个月传代35代和反复冻存复苏6次,培养上清稳定性良好.6株McAb腹腔积液效价分别为2.8×104(EKG7)、5.1×105(EKG14)、5.1×105(EKG16)、5.1×105(EKG18)、5.1×105(EKG25)、3.2×104(EKG28).电泳结果证明,盐析法纯化腹腔积液得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为8.07 mg、3.35(A450)、3.10(A450),蛋白G亲和层析法得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为0.32mg、1.83(A450)、0.66(A450),盐析法优于蛋白G亲和层析法(t=25.26,P＜0.01).抗体的佳应用浓度为(50～150)μg/L.临床初步鉴定发现,6株EKGPDP单克隆抗体在骨性关节炎及突出椎间盘软骨标本中出现了不同程度的阳性结果.结论 本研究成功获得抗Ⅱ型胶原C端肽片段McAb,为Ⅱ型胶原降解产物的测定提供了研究工具.
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腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子对体外转染恒河猴和人腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原影响的比较
目的 比较腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对体外培养的恒河猴和人腰椎间盘细胞转染后蛋白多糖含量和Ⅱ型胶原的影响.方法 将恒河猴及成人腰椎间盘髓核细胞进行体外培养,应用Raav2-CTGF体外转染细胞,分别通过35S标记蛋白多糖的方法和Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法检测腺相关病毒载体介导生长因子对椎间盘细胞蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的影响.结果 恒河猴椎间盘细胞能进行体外培养并传代,其形态学特性与培养的成人椎间盘细胞相似,Raav2-CTGF与对照组相比可促进恒河猴和人椎间盘髓核细胞的蛋白多糖生物合成(P<0.01),恒河猴和成人相比生长因子对于蛋白多糖的促进作用无明显差异(P>0.05).结论 成功培养恒河猴及成人椎间盘细胞,腺相关病毒载体介导CTGF能显著促进髓核细胞蛋白多糖的合成,生长因子对恒河猴和人椎间盘细胞蛋白多糖含量的影响具有很大的相似性.
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不同强度张应力刺激影响关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的研究
目的 观察不同强度张应力刺激对人体体外培养的关节软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响.方法 获取因股骨颈骨折行髋关节置换术患者的股骨头关节软骨细胞.对第一代关节软骨细胞分别施加强度为3%、6%、15%延伸率的张应力刺激,张应力刺激后提取细胞的总RNA,进一步逆转录成cDNA, 实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达.结果 虽然3%和6%的张应力刺激均可增加Ⅱ型胶原mRNA的表达,但没有统计学意义;15%的张应力刺激能明显抑制Ⅱ型胶原mRNA的表达,且有统计学意义.尽管张应力刺激均可增加聚集蛋白聚糖mRNA的表达,但均没有统计学意义(P＞0.05).结论 不同强度的张应力刺激对关节软骨细胞表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的影响不同.15%延伸率的张应力刺激可明显抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原基因的表达,但不能明显改变聚集蛋白聚糖基因的表达,这可能与关节软骨细胞的功能适应性有关.
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芍药苷对胶原诱导型关节炎大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响
目的 探讨芍药苷治疗胶原诱导型关节炎(ClA)是否与调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴有关.方法 Wistar大鼠右足趾皮内注射牛Ⅱ型胶原(Cli)和弗氏完全佐剂制备CIA大鼠模型,7d后大鼠背部和尾根部皮下注射C Ⅱ加强免疫1次.初次免疫后第14天ig给予地塞米松2 mg·kg-1或芍药苷25,50和100 mg·kg-1,每天1次,连续28 d.初次免疫后第14,21,28,35和42天观察CIA大鼠的足爪肿胀度和关节炎指数的变化.给药结束后第2天大鼠摘眼球取血,放射免疫法检测血浆促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CS)含量;制备血清,用ELISA法检测白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-13、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗CⅡ抗体含量.结果 与正常对照组相比,模型对照组大鼠关节红肿,关节炎指数升高(P＜0.01),血中CRH、CS、抗CⅡ抗体、IFN-γ、IL-13和TNF-α水平明显升高(P＜0.01),IL-4水平下降(P＜0.01),ACTH无明显改变.ig给予芍药苷50和100 mg·kg-1可抑制CIA大鼠关节肿胀,降低关节炎指数(P＜0.05),在第42天关节炎指数由模型对照组的6.4±0.7降至5.6±0.5和5.4±0.7(P＜0.05);使模型对照组血清IFN-γ由(21.3±2.5)ng·L-1降至16.6±1.3和(16.1±1.9)ng·L-1 (P＜0.01),IL-1β由(37.3±4.2)ng·L-1降至32.1±2.9和(31.2±4.1)ng·L-1(P ＜0.01),TNF-α由(53.9±7.9)ng·L-1降至39.4±6.8和(31.3±6.1) ng·L-1 (P＜0.01),抗CⅡ抗体由(2.13±0.32)ng· L-1降至1.35 ±0.58和(1.10±0.42)ng·L-1 (P＜0.01),IL-4由(26.6 ±3.0) ng·L-1升至41.9 ±3.1和(49.1±4.2)ng·L-1(P＜0.01);能使血浆CRH的水平由模型对照组的(2.3 ±0.5)μg·L-1升高至4.9±1.0和(5.3±1.1)μg·L-1(P＜0.01),CS由(33±1O)μg· L-1升高至47±9和(51±13)μg·L-1(P＜0.01),ACTH水平亦有明显升高(P＜0.01).结论 芍药苷治疗CIA可能与调节PHA轴有关.
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雷公藤内酯醇对大鼠胶原性关节炎和免疫功能的影响
目的 研究雷公藤内酯醇(TP)对胶原性关节炎(CIA)的治疗作用.方法 制备鸡Ⅱ型胶原诱导的CIA大鼠模型,im给予地塞米松2.0 mg·kg-1或TP0.1,0.2和0.4 mg·kg-1,每3天1次,连续35 d,正常对照和模型对照组im给予等体积生理盐水.实验过程中观察CIA大鼠的一般情况、足爪肿胀度和关节炎指数的变化.给药结束后第2天,3％巴比妥钠麻醉处死大鼠,取足爪组织制备组织切片观察病理变化；无菌取脾制备脾细胞悬液,用MTT法检测脾T细胞和B细胞增殖反应；制备10％脾组织匀浆,用ELISA法检测脾组织白介素1 β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6；心脏取血,制备血清用ELISA法测定血清中抗CⅡ抗体水平.结果 与正常对照组比较,模型对照组大鼠关节红肿,表面皮肤发亮充血,关节炎指数上升,脾T细胞和B细胞增殖反应、血清中抗CⅡ抗体水平和脾组织中IL-1β,TNF-α和IL-6水平明显升高(D＜0.01),大鼠足爪皮下组织细胞排列紊乱且有大量炎性细胞浸润及血管增生.im给予TP 0.2和0.4 mg·kg-1可改善CIA大鼠一般状况,明显抑制CIA大鼠足爪肿胀(P＜0.01)；降低关节炎指数,在第22,26,30和35天由模型对照组的7.3±0.7,6.3±0.8,4.7±0.7和4.3±0.2分别降低到5.6±0.6,4.9±0.7,3.9±0.5,2.8±0.7和5.1±0.8,4.1±0.4,3.3±0.6,2.7±0.6；抑制脾T和B细胞增殖反应；血清中抗CⅡ抗体水平显著降低,A490nm由模型对照组的0.765±0.018降低到0.583±0.024和0.575±0.034(P＜0 01)；脾组织中IL-1β由(159±23) ng·L-1降低到90±15和(79±15)ng·L-1(P＜0.01),TNF-α由(125±23) ng·L-1降低到94±16和(83±17) ng·L-1(P＜0.01),IL-6由(250±16) ng·L-1降低到193±18和( 180±18) ng·L-1(P＜0.0l)；能明显改善大鼠足爪组织病理改变,炎性细胞浸润及血管明显减轻(P＜0.05).TP 0.1mg·kg-1对上述指标无明显影响.结论 TP对Ⅱ型胶原诱导的CIA具有一定的治疗作用.
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Ⅱ型胶原多肽263～272序列中多个氨基酸替换的意义及其在胶原性关节炎治疗中的作用
目的:研究Ⅱ型胶原变构肽(APL)中氨基酸替换对胶原性关节炎(CIA)的抑制作用,为类风湿关节炎(RA)的多肽免疫治疗提供试验依据.方法:以丙氨酸替换Ⅱ型胶原(CⅡ)263～272多肽中与T细胞受体(TCR)结合的氨基酸,3H掺入法检测变构肽对RA患者外周血T细胞活化的竞争抑制作用,筛选用于CIA治疗的变构肽.以牛CⅡ诱导大鼠CIA模型,应用不同剂量(1, 10, 100 μg)的CⅡ变构肽每周2次皮下注射,观察大鼠关节肿胀的变化情况.治疗3周后(初次免疫后第35天)处死大鼠,进行X线及病理评分.ELISA法检测血清IFN-γ水平.结果:3条CⅡ263～272变构肽均不同程度抑制CⅡ原型肽对RA患者T 细胞的活化.其中,同时替换267位谷氨酰胺(Q)、270位赖氨酸(K)和271位甘氨酸(G)为丙氨酸(A)的APL3效果好.应用APL3对CIA进行治疗的结果发现,100 μg治疗组CIA大鼠的关节炎指数、X线及病理评分均显著低于PBS对照组.血清IFN-γ水平也较PBS对照组明显下降.而无关肽组与PBS对照组相比,关节炎指数、X线和病理评分以及血清IFN-γ水平均无明显差别.结论:TCR结合氨基酸位点替换后的CⅡ263～272多肽具有T细胞低反应性和对原型肽的竞争抑制作用,并可抑制大鼠胶原性关节炎的发展,提示其抑制RA免疫异常的可能性.
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类风湿关节炎患者人类白细胞抗原-DR4/1表型与Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及血清Ⅱ型胶原抗体的关系
目的:探讨类风湿关节炎 (RA) 患者HLA-DR4/1表型与Ⅱ型胶原 (CⅡ) 263-272 多肽特异性T细胞增殖和血清CⅡ263-272抗体之间的关系. 方法:将CⅡ263-272多肽与70例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育5天,用3H参入法测定T细胞增殖,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者血清CⅡ263-272抗体水平.以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术对上述患者进行HLA-DR分型.结果:在70例RA患者中,27例HLA-DR4/1表型阳性,43例HLA-DR4/1表型阴性.在HLA-DR4/1表型阳性的RA患者中,CⅡ263-272多肽可刺激T细胞增殖的有15例(55.6%),12例(44.4%)呈无反应性;18例(66.7%) 患者抗CⅡ263-272抗体阳性.而在HLA-DR4/1表型阴性的RA患者中,T细胞对CⅡ263-272多肽有反应性者13例(30.3%),无反应性者30例(69.7%);15例(34.8%) RA患者抗CⅡ263-272抗体阳性.HLA-DR4/1表型阳性组CⅡ263-272特异性细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成均高于HLA-DR4/1表型阴性组.结论:RA 患者CⅡ263-272 特异性T细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成与HLA-DR4/1表型有关.
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骨形成蛋白-7对多孔钽／软骨细胞复合物分泌功能以及 Col-Ⅱ、AGG 和 Sox9基因表达的影响
目的：研究人重组骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）对国产多孔钽／软骨细胞复合物中软骨细胞分泌功能以及Ⅱ型胶原（ typeⅡcollagen，Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（ aggrecan，AGG）和SRY相关高迁移率组基因9（SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9）mRNA表达的影响。方法：3周龄新西兰幼兔，取双膝关节软骨细胞分离培养及鉴定，将生长状态良好的第2代细胞以1×106／mL浓度接种于多孔钽并给予不同浓度BMP-7，分为对照组（多孔钽／软骨细胞组）、50μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组、100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组及200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组。 CCK-8法检测不同浓度BMP-7对多孔钽／软骨细胞生长及增殖的影响，扫描电镜观察各组软骨细胞在多孔钽表面及内部生长情况，二甲基亚甲蓝（ dimethyl methylene blue，DMMB）比色定量法对BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合物糖胺多糖（ glycosaminoglycan，GAG）进行定量检测，实时荧光定量PCR检测Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA的表达。结果：原代软骨细胞培养24 h后呈梭形生长，4 d后细胞呈多角形，胞浆丰富。阿辛蓝（ alcian blue）、番红O（ safranin O）、Col-Ⅱ免疫细胞化学染色均呈阳性反应。 CCK-8法细胞增殖检测结果显示，100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组细胞增殖水平高于其他各组（ P＜0．05）。扫描电镜示各组软骨细胞在多孔钽表面生长状态良好，细胞有多个突起、伸展、叠层生长并覆盖于多孔钽表面。 GAG定量检测显示，100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组GAG含量比其他各组均明显升高（ P＜0．05）；实时荧光定量PCR检测显示，各实验组Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA表达量均高于对照组，以200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组升高为明显（ P＜0．05）。结论：BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合体能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质的分泌，促进软骨基因的表达。
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Ⅱ型胶原变构肽鼻黏膜给药治疗胶原诱导性关节炎的实验研究
目的:研究以丙氨酸替换Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ,CⅡ)263-272序列中的267、270、271位氨基酸的变构肽鼻黏膜给药对胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)的抑制作用及其作用机制.方法:以牛CⅡ免疫Lewis大鼠诱发CIA.于发病的当天开始给予CⅡ变构肽和原型肽鼻滴入治疗,连续每天给药,5 d后,改为隔天给药,空白对照组给予磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS).观察关节肿胀情况,记录关节炎评分以及体重的改变.治疗结束后处死大鼠,行后踝关节病理切片,观察关节病理改变.ELISA方法检测血清巾抗C Ⅱ抗体亚型以及细胞因子的变化,流式细胞仪检测外周血 CD4+CD25+T细胞的变化,荧光定量PCR检测脾和淋巴结中Foxp3和TGF-β mRNA的表达水平.结果:(1)CⅡ变构肽可以抑制CIA的发展.实验结束时CⅡ变构肽、原型肽以及PBS组大鼠关节炎评分分别为2.50±2.43、4.50±2.23和6.33±2.73(变构肽治疗组与PBS对照组比较,P<0.05),各组大鼠后踝关节病理学评分分别为1.33±1.07、2.17±0.94和2.83±0.58,与PBS对照组相比,CⅡ变构肽可以明显抑制CIA关节病变的发展(P<0.05).(2)与PBS对照组相比,CⅡ变构肽可以降低CIA大鼠体内抗CⅡ抗体IgG2a亚型的滴度(0.56±0.19和0.95±0.29,P<0.05).C Ⅱ变构肽、原型肽及PBS对照组大鼠血清中γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平分别为(185.33±29.77)、(231.62±41.82)和(220.64±83.61)ng/L,与原型肽组相比,CⅡ变构肽可以降低大鼠血清中IFN-γ水平.(3)CⅡ变构肽治疗对调节性T细胞的影响:3组大鼠外周血CIM+CD25+T细胞占CD4+T细胞比例差异无统计学意义,CⅡ变构肽治疗组大鼠脾和淋巴结中Foxp3和转化生长因子B(transforming growth factors β,TGF-β)mRNA的表达水平较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义.结论:C Ⅱ变构肽鼻黏膜给药治疗可以抑制CIA的发展,CⅡ变构肽可能主要通过抑制CIA大鼠体内IgG2a型抗CⅡ抗体的产生,并降低血清中IFN-Ⅱ,从而抑制Th1型免疫反应而发挥治疗作用.
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乌司他丁治疗胶原诱导关节炎的实验研究
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性关节炎症和骨质破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病,如不经正规治疗,可出现关节畸形,严重影响患者的生活质量.RA的基本病理特征是滑膜炎伴关节软骨和骨质的破坏,炎症细胞浸润、滑膜细胞过度增殖以及破骨细胞活化均参与RA的病理过程.其中T淋巴细胞活化及炎性细胞因子表达增加在RA的发生和发展过程中起了非常重要的作用.
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抗瓜氨酸化Ⅱ型胶原抗体的检测及其与类风湿关节炎的相关性研究
目的 探讨瓜氨酸化Ⅱ型胶原及其抗体在类风湿关节炎(RA)发病和诊断中的意义.方法 用肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化牛Ⅱ型胶原(bCⅡ)中的精氨酸转变为瓜氨酸,用ELISA和免疫印迹的方法检测RA患者(175例)、系统性红斑狼疮(SLE)患者(112例)、骨关节炎(OA)患者(37例)和健康对照组(160例)的血清对瓜氨酸化牛Ⅱ型胶原(Cit-bCⅡ)的抗体水平,并研究其与RA患者抗环瓜氨酸(CCP)抗体、C反应蛋白(CRP)、血红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子(RF)及双手X线分期、病程、年龄的关系.结果 RA患者抗Cit-bCⅡ抗体的阳性率为50.3%(88/175),与其抗bCⅡ抗体的阳性率33.7%(59/175)相比,有显著提高.RA患者抗Cit-bCⅡ抗体阳性率明显高于SLE患者的17.9%(20/112)、OA患者的18.9%(7/37)和健康对照组的2.5%(4/160)(均P＜0.05).而SLE患者、OA患者抗Cit-bCⅡ和抗bCⅡ抗体的阳性率比较,差异无统计学意义.RA患者抗Cit-bCⅡ抗体与抗CCP抗体相关,与CRP、ESR、RF、双手X线分期、病程和年龄均无明显相关性.结论 瓜氨酸化CⅡ及其抗体可能在RA发病和病理过程中起重要作用.
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腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应
目的比较研究腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体介导人转化生长因子β1(human transforming growth factor β1,hTGFβ1)与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒(pSNAV2),分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.
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血管抑素k1-5转基因治疗Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎
目的:探讨腺病毒介导的血管抑素k1-5对Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎的治疗作用.方法:在体外验证表达血管抑素k1-5的腺病毒载体对血管内皮细胞的抑制作用的基础上,将其应用于胶原蛋白诱导的关节炎鼠模型,以探讨其对关节炎的治疗作用,以临床评分和爪厚度来评价治疗效果.结果:鼠腹腔内注射表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能显著降低关节炎鼠模型临床评分及爪厚度(P＜0.05).结论:本试验初步证实表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能明显改善Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎,可作为关节炎治疗的有效途径.
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兔膝骨性关节炎软骨损伤及降钙素的保护作用
目的:探讨兔膝骨性关节炎(KOA)时的软骨损伤及降钙素(CT)的保护作用.方法:将36只健康大耳白兔随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)和CT治疗组(C组),B、C组采用改良Hulth法复制膝骨性关节炎模型,A组除切开皮肤和关节腔外,不做其他处理,从术后第6周开始C组每天皮下注射CT 5 U/kg,A、B组给与等量生理盐水皮下注射,连续注射20d后处死动物.观察关节软骨病理组织学和关节液肿瘤坏死因子(TNF)-α、一氧化氮(NO)及关节软骨Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶(MMP)-1的变化,以及降钙素对上述指标的影响.结果:与A组相比较,B组JP和Mankin’S评分升高,关节软骨损伤加重,关节液中TNF-α、NO水平升高(P＜0.05),关节软骨Ⅱ型胶原含量降低,MMP-1活性升高(P＜0.05)；与B组相比,C组关节液中TNF-α、NO水平降低(P＜0.05),关节软骨损伤减轻、Ⅱ型胶原含量升高,MMP-1活性降低(P＜0.05).结论:CT可能通过抑制TNF-α、NO的表达而对KOA软骨损伤起保护作用.
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兔椎间失稳后弹性内固定软骨终板Ⅱ型胶原蛋白变化的实验研究
目的 观察兔软骨终板在椎间失稳环境下,经弹性内固定重建椎间稳定,软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的变化,为腰腿痛疾病的治疗提供新的思路和方法.方法 选取36只6个月龄日本大耳白兔,雄雌不限,体质量(2.5±0.15) kg,随机分为对照组和实验组各18只.先将实验所用36只兔制作成L6/7椎间手术失稳模型;实验组在手术失稳2个月后用椎弓根螺丝钉和张力钢丝弹性内固定的方法进行L6/7的稳定性重建,术后2、4、6个月分别取2组兔椎间盘软骨终板(每个时点6只),用免疫组织化学的方法检测Ⅱ型胶原蛋白,用JD801图像分析系统进行图像分析,综合判断软骨终板的退行性变过程及机制.结果 实验组手术进行椎间失稳张力钢丝弹性内固定稳定性重建后,2、4、6个月短期内椎间软骨终板厚度较对照组明显变厚,软骨细胞显著增加.实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月逐渐下降,实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月均低于对照组(P＜0.01);实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月逐渐升高,实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月均高于对照组(P＜0.01).结论 弹性内固定能有效阻止软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的退行性变;而且有部分恢复的征象,为进一步进行其他治疗创造了必要条件.
