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结核分枝杆菌持留相关PcaA和Acr蛋白的表达纯化及初步应用
目的结核分枝杆菌(M.tb)潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一,目前的检测方法很难将潜伏感染结核病(LTBI)和活动性结核病(ATB)区分开.有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶(PcaA)和小分子热休克晶体蛋白(Acr)两个基因在M.tb持留状态下高表达,因此可能和菌的潜伏感染相关,有作为新的诊断靶标的可能,因此我们对它们开展了有关的研究和应用,以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法.方法首先针对目的基因设计引物,从基因组上扩增其全序列,构建克隆和表达载体,纯化分离蛋白.将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测,用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平,终经过统计学处理,分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异,寻找可应用于临床诊断分析的方法和策略.结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体,并获得表达和纯化的蛋白.血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照(HC)与ATB之间差异有统计学意义,而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义,即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义.结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化,PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性,可用于以后对结核病的检测分析中;虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB,但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否.
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毒素-抗毒素系统及其典型模型研究进展
毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌及古细菌基因组,毒素与抗毒素共表达形成稳定的复合物,毒素蛋白稳定而抗毒素不稳定.在压力条件下,被激活的毒素蛋白通过作用于旋转酶、mRNA、细胞膜等靶标,导致细菌生长持留或细胞死亡.大量关于毒素-抗毒素系统的报道,试图阐述病原菌本身的作用与毒素-抗毒素系统之间的关系.通过构建不同的试验模型及实验方法,探索所研究的毒素-抗毒素系统可能发挥的生理作用.目前研究已初步形成了一些理论模型,但是仍然存在许多的疑问.其中,以毒素-抗毒素系统为靶点,通过人工激活毒素-抗毒素系统,释放游离的毒素蛋白杀死病原菌或病毒,被认为是一种潜在的新型抗菌或抗病毒策略.研究毒素-抗毒素系统特征及其生物学功能,尤其是毒素-抗毒素参与的细菌持留模型和细菌程序性细胞死亡模型,有助于开发抗菌药及抗病毒药.
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Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究
目的 探讨Sigma E(sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究.方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证.重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达.设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性.采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E(resuscitation-promoting factor E,RpfE)的7H9中静置培养2周,计数大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制.结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达.与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降.5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组.结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性.
