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不育患者精子头部超微结构变化的电镜观察
目的 观察精子头部的正常和异常超微结构,依据两者的差异,探讨精子头部损伤引起不育的机理.方法 取正常人和不育患者精子,在光学显微镜观察后,制备冷冻蚀刻复型膜和超薄切片样品,在透射电镜下观察并拍照.结果 冷冻蚀刻复型膜观察可见正常精子头是由质膜包裹的细胞核和顶体构成,分前中后三区;细胞核染色质为螺旋状,规则排列为8～11行;核膜孔位于后头区,有140～180个,分6排,呈六角形排列.异常精子头表现为质膜破裂、不光滑,膜蛋白变性、脱落、凝聚,细胞核内出现大空洞,染色质断裂、紊乱,核膜孔数量减少、排列紊乱.结论 本研究提供了正常及异常精子头部的各种超微结构表现,可作为研究精子膜结构及不育机理的参考.正常精子头的细胞核呈高度有序结构,而异常精子头部有不同程度损伤;冷冻蚀刻复型膜技术是在超低温,高真空条件下将质膜从双分子层的疏水区劈开,在透射电镜下清晰地观察到E面和F面的结构和膜蛋白数量分布等,是显示精子膜结构和膜损伤的佳技术手段.
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不育症患者精子尾部超微结构改变的观察
目的 观察男性不育患者精子尾部超微结构改变,探讨精子运动障碍导致男性不育的机理. 方法 选择男性不育精液,制备精子超薄切片、冷冻蚀刻复型膜和表面喷塗样品,在透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察. 结果 1.精子尾部线粒体排列紊乱,外膜内嵴破裂;2.密纤维分离,密纤维与轴丝二联管颠倒,轴丝二联管缺损,放射辐、近邻连接断裂,内外动力臂缺损;3.膜结构凹凸不平,膜蛋白脱落或凝聚等. 结论 精子尾部中段线粒体结构破坏是精子丧失运动能力的关键;精子尾部轴丝密纤维等病理改变不能有效利用ATP,导致精子死亡;不育患者精子均出现磷脂双分子层结构改变和膜蛋白变性造成的脱落和凝聚.
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热暴露对大鼠小肠上皮细胞膜结构及生化指标的影响
热暴露能显著影响组织和细胞的正常生理功能,已为许多研究证实.但尚不清楚其确切机制.我们探讨热暴露对大鼠小肠上皮细胞膜结构以及某些生化指标的影响,了解热暴露时小肠上皮细胞膜结构改变的特点.
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醋酸钙梯度法制备阿魏酸脂质体的研究及体外评价
目的 采用醋酸钙梯度法制备阿魏酸脂质体,考察其制备工艺及理化性质,进行体外释放度及稳定性评价.方法 以包封率为指标,考察阿魏酸脂质体胆固醇含量、脂药比、孵育时间、孵育温度、钙离子浓度等因素对包封率的影响.评价其粒径、Zeta电位、体外释放、稳定性.采用冷冻蚀刻电镜观察其显微结构.结果 磷脂-胆固醇比例为0.5,脂药比为26,钙离子浓度120 mol·L-1,孵育条件为37℃,30 min制备的脂质体包封率达80.2%,粒径152 nm.荷电脂质体粒径增加.Zeta电位升高.载药脂质体Zeta电位降低,粒径无变化.体外5 h释放80%.30 d内包封率及粒径均无显著变化.结论 通过工艺和处方考察优选出佳制备条件,制得的阿魏酸脂质体为单室结构,包封率高,稳定性好.
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Duchenne和Becker型肌营养不良症的电镜观察
目的本研究通过观察Duchenne和Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者超微病理的特征,从亚细胞水平上探讨其病因和发病机制.方法应用电子显微镜,采用超薄切片和冷冻蚀刻技术观察9例DMD/BMD患者超微结构的改变.结果(1)DMD/BMD透射电镜发现:"Z"线模糊不清,宽窄不一,间距变窄,肌原纤维明带增宽,肌原纤维过度收缩.血管内皮细胞肿胀,毛细血管闭塞,闭塞的毛细血管内皮细胞中可见大量饮液泡;肌原纤维粗细不等,肌浆网明显扩张,肌浆网侵入肌原纤维间,呈虫食样,肌浆网中可见浓缩的包涵物.肌丝排列紊乱,肌浆网管扩张,肌丝间网聚集;线粒体中间段大空泡,肌丝间网较明显,糖原颗粒聚积.(2)DMD骨骼肌冷冻蚀刻电镜图像示:肌原纤维间存在同心圆状排列的板层体;粗细肌丝排列紊乱,正常的六角形点阵结构消失.结论(1)DMD/BMD超微结构改变表现为肌纤维的坏死和细胞膜的破坏.(2)肌纤维内毛细血管闭塞,血管内皮细胞肿胀,间质毛细血管血流瘀滞.表明DMD/BMD可能还存在血液循环障碍,有待进一步证实.
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细胞膜之间的蛋白颗粒计数
众所皆知,细胞膜之间的膜蛋白颗粒即脂质双分子中镶嵌的蛋白微粒,这些微粒用常规透射电镜技术则无法观察到.自1970年电镜冷冻蚀刻法(freeze etching)发展以来,已成为研究包括膜间蛋白颗粒、细胞表面连接在内等生物膜结构的重要方法[1].作者自1993年以来利用该技术分别对正常人与Duchenne型肌营养不良症(DMD)及其携带者的红细胞及骨骼肌细胞膜间蛋白颗粒进行定量计数研究[2,3],观察其在不同状态下颗粒数的变化,以进一步阐明其发病机制.本文主要探讨影响蛋白颗粒计数的因素及其意义.因各组的实验、颗粒计数及统计方法都相似,且该病的骨骼肌与红细胞结果一致,而红细胞具有取材方便等优点[4],故以正常人与DMD携带者红细胞之间的膜蛋白颗粒数比较为例详加介绍.
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红细胞电镜冷冻蚀刻技术的图像识别及真空喷镀
红细胞具有取材方便,病人痛苦少,重复性高等优点在某些科研或疾病诊断中受到关注[1].国内外应用电镜冷冻蚀刻技术对红细胞进行观察研究的报道,多为红细胞膜蛋白颗粒数量或分布变化的研究[2～6],我室曾对肌营养不良症及其基因携带者的红细胞膜蛋白颗粒进行研究[4,5].由于红细胞与其他组织或单细胞相比具有某些特殊性,本文对其电镜图像识别及真空喷镀技术要点予以介绍.
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三种电镜技术在细胞紧密连接研究中的应用
细胞紧密连接是细胞侧表面的特化结构,随着电镜技术与其他生物技术的发展,对其结构与功能的研究不断深入.电镜技术在该领域中的应用已日趋广泛[1～3],常用的有电镜常规超薄切片技术、硝酸镧示踪电镜细胞化学技术和电镜冷冻蚀刻技术.各种方法各有其优缺点,观察的侧重点也不一样.本文介绍三种技术的各自特点,探讨如何根据科研工作需要,选择合适的方法,以达到预期结果.
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红细胞膜蛋白颗粒冷冻蚀刻图像反差不良的原因分析
目的:探讨了红细胞膜蛋白颗粒冷冻蚀刻图像反差不良的相关因素,解决在应用电镜冷冻蚀刻技术制备红细胞膜蛋白颗粒样品的过程中,部分颗粒图像模糊、反差不良,颗粒粘连严重,导致辨识与计数困难的问题.方法:本实验通过采集DMD基因携带者外周静脉血样品,经过抗凝、离心、固定和防冰晶等处理步骤后,应用HUS-5型真空喷镀仪及配套装置,在-100℃条件下制备复型膜.在以往工作的基础上,分析蛋白颗粒图像成因,采取在喷镀过程中控制喷镀电流与真空度,以及在喷镀前精选喷镀源,并在仪器准备阶段注重真空系统良好的清洁和维护等多种手段,制备出了质量良好的冷冻蚀刻复型膜.结果:制备出的复型膜在电镜下显示的蛋白颗粒图像清晰可辨,反差良好.部分改善了图像质量,收到良好的效果.结论:采用精心烧制并优选喷镀源,在冷冻蚀刻实验过程中注重喷镀电流与真空度的配合,结合改进实验器材的准备工作等方法,可提高膜蛋白颗粒冷冻蚀刻图像的质量,制备出边界清晰,背景杂质较少,易于识别的蛋白颗粒复型膜.
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玻璃体胶原纤维的空间结构及纤溶酶对其空间结构的影响
目的观察玻璃体胶原纤维的空间结构及纤溶酶对其空间结构的影响. 方法取新鲜猪眼玻璃体20个,随机分2组,一组的10个玻璃体中分别加入用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)配制的浓度为3 U/ml的人纤溶酶消化液1 ml, 另一组的10个玻璃体中分别加入等量的PBS作为对照.均置于密闭的容器,在37℃的细胞培养箱中孵育24 h, 固定剂固定.分别取玻璃体基底部、皮质和中央区的标本进行冷冻断裂、深度蚀刻联合透射电子显微镜检查. 结果玻璃体的胶原纤维形成有机的网状结构,具有稳定的空间构像.各部位纤维密度不均,基底部密集,皮质部次之,中央区胶原纤维稀疏.纤维之间具有更加细小的纤维丝相连,以纤维交汇处为著.经过纤溶酶消化后,玻璃体胶原纤维的网状结构破坏. 结论玻璃体内胶原纤维呈三维空间结构,纤溶酶能够破坏玻璃体胶原纤维的网状结构.
关键词： 玻璃体/解剖学和组织学 纤溶酶 冷冻蚀刻 -
肥大心肌缝隙连接的超微结构及临床意义
采用电镜冷冻蚀刻和超薄切片的方法观察了大鼠腹主动脉狭窄致左室肥厚心肌细胞缝隙连接(GJ)的结构特点.结果发现,心肌细胞超微结构损伤严重,闰盘肿胀、扩张,冷冻蚀刻法见PF面颗粒排列紊乱、颗粒的中心距离变大.这种细胞间电活动传导通路的结构变化,可认为是高血压心肌肥大时产生心律失常的一种基础.
