实验性防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX在小鼠体内分布和表达
摘要： 本研究将实验疫苗经滴鼻免疫后定量PCR应用于检测不同时间DNA疫苗pGJA-P/VAX在小鼠体内各组织中的分布及其在接种部位与引流淋巴结内mRNA的表达情况,从而为DNA疫苗产生持续性免疫应答的机制提供试验数据,对该疫苗进一步研究提供了安全性方面的试验资料.
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5种沙眼衣原体分泌蛋白对小鼠巨噬细胞和树突状细胞吞噬功能的影响
目的 探索5种沙眼衣原体分泌蛋白在体外对小鼠巨噬细胞和树突状细胞吞噬功能的影响.方法 原核表达蛋白GST-CT311、GST-GIgA、GST-cHtrA、GST-OmcBc和GST-Pgp3中,同时表达了衣原体膜蛋白GST-IncA作为对照,经谷胱甘肽巯基转移酶( GST)磁珠纯化、PreScission蛋白酶切除GST标签后得到蛋白CT311、GIgA、cHtrA、OmcBc、Pgp3以及IncA.取C3H/HeJ小鼠骨髓细胞制备巨噬细胞和树突状细胞,分别用100 μg/ml和500 μg/ml的蛋白质预处理巨噬细胞和树突状细胞,4 h后加入荧光珠,1 h后固定细胞,直接免疫荧光法计数每100个细胞吞噬荧光珠的平均数量(吞噬量)及每100个细胞中吞噬的细胞百分比(吞噬率).结果 高、低浓度蛋白质组对巨噬细胞及树突状细胞的吞噬率均无明显影响;与无处理组相比,LPS以及低浓度(100 μg/ml)的各蛋白组对巨噬细胞和树突状细胞的吞噬量无明显影响;高浓度组(500 μg/ml)的Pgp3、cHtrA及CT311预处理的巨噬细胞和树突状细胞吞噬量明显升高,GIgA、OmcBc以及IncA对巨噬细胞和树突状细胞的吞噬量无明显影响.结论 在体外,沙眼衣原体分泌蛋白Pgp3、cHtrA及CT311可以促进巨噬细胞和树突状细胞的吞噬功能,这可能有助于沙眼衣原体在宿主体内的播散感染.
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滤泡辅助性T细胞及其相关因子在HIV疾病进展中的变化研究
目的 通过对不同疾病进展阶段的HIV感染者外周血滤泡辅助性T细胞( follicular helper T cell, Tfh)进行分析,探讨Tfh及其相关因子对HIV感染疾病进程的影响,为进一步研究Tfh在HIV抗病毒治疗和疫苗研究提供科学依据.方法 本研究招募HIV-1感染者33例,根据疾病进展情况分为HIV-1长期不进展者(long-term nonprogressors, LTNP)11例、快速进展者(rapid progressors, RP)10例、HIV典型进展者(typical progressors, TP)12例,同时招募11名健康人(normal control, NC)作为对照.分离受试者外周血单个核细胞,用多色流式的方法检测 CD4+CD45RA-CXCR5+Tfh 和CD4+CD45RA-CXCR3-CXCR5+PD-1+Tfh及其表达ICOS、IFN-γ、IL-21因子的水平.此外,对血浆IL-10和CD19+B细胞频数也进行分析,探讨Tfh与CD4、B细胞的关系.结果 两个Tfh亚群比例在HIV-1感染人群均比正常对照高,CD4+CD45RA-CXCR5+Tfh在LTNP人群高,与正常对照比较差异有统计学意义(P<0. 05). Tfh相关因子ICOS、IFN-γ、IL-21在T细胞刺激剂作用下均有明显升高,ICOS+Tfh与HIV-1疾病进展呈负相关,与CD19+B细胞呈正相关(r=-0. 49,P<0. 01;r=0. 60,P<0. 05).血浆IL-10的浓度在HIV-1感染者中有明显升高,TP组高,其次为RP组(TP组vs NC组,P<0. 01;RP组vs NC组,P<0. 05).结论 外周血Tfh及其相关因子的表达在HIV-1感染者与健康对照者间差异有统计学意义,特定亚群Tfh与HIV-1疾病进展和B细胞功能密切相关.
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重组铜绿假单胞菌分泌蛋白PA3611诱导支气管上皮细胞-间充质转化的初步观察
目的 探讨重组蛋白PA3611能否在体外使大鼠支气管上皮细胞发生上皮-间充质转化(EMT).方法 通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白PA3611;利用CCK-8法检测PA3611刺激对支气管上皮细胞增殖的影响;镜下观察经PA3611作用后支气管上皮细胞的形态学变化;运用Western blot法和qPCR法检测支气管上皮细胞细胞E-钙粘蛋白(E-CAD)与 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平.结果 DNA测序证实成功制备重组蛋白PA3611;重组蛋白PA3611刺激能抑制支气管上皮细胞的增殖(P<0.05),诱导其细胞形态学发生EMT变化,抑制E-CAD表达及促进α-SMA的表达(P<0.05).结论 重组铜绿假单胞菌分泌蛋白PA3611可以诱导大鼠支气管上皮细胞发生EMT,其具体机制值得进一步深入探讨.
关键词： 重组蛋白PA3611 铜绿假单胞菌 上皮-间充质转化 -
贵阳地区224例哮喘患儿IL-17基因多态性及其与血清TIgE水平的相关性研究
目的 探讨白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)基因启动子区-152G/A和IL-17F基因外显子区7488T/C位点单核苷酸多态性(SNPs)对儿童支气管哮喘及血清总IgE(TIgE)水平的影响.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测224例哮喘组儿童[男性152例,女性72例,男女比例为2.11:1,平均年龄(6.11±3.27)岁]和150例健康对照组儿童[男93例,女57例,男女比例为1.63:1,平均年龄(5.61±3.55)岁]IL-17A-152G/A位点和IL-17F 7488T/C位点的基因多态性,并选取部分样本进行PCR产物测序,对酶切结果进行验证;采用贝克曼库尔特实验系统IMMAGE800特定蛋白分析仪以散射比浊法自动检测哮喘组和对照组儿童血清TIgE水平.结果 IL-17A-152G/A在哮喘组和对照组均检出AA、AG、GG三种基因型,此位点的基因型频率分布在两组间的差异有统计学意义(P<0.05).IL-17A-152G/A位点的A变异等位基因携带者患病的危险性高于非携带者,差异有统计学意义(P<0.05).IL-17F 7488T/C位点在哮喘组和对照组均检出TT、TC、CC三种基因型,该位点两组基因型和等位基因的频率分布差异有统计学意义(P<0.05);哮喘组和对照组血清TIgE水平比较差异有统计学意义(P<0.05);IL-17A-152G/A位点哮喘组AA、AG、GG三种基因型对应血清TIgE水平比较差异有统计学意义(P<0.05),AA基因型高于AG基因型(P=0.001)和GG基因型(P=0.001);对照组3种基因型间血清TIgE间比较差异无统计学意义.IL-17F 7488T/C位点哮喘组和对照组TT、TC、CC三组基因型间血清TIgE水平比较差异均无统计学意义(P>0.05);结论 IL-17基因两位点多态性与贵阳地区儿童哮喘的发病有相关性.IL-17A-152G/A多态性位点是贵阳地区哮喘的重要候选基因;变异等位基因A与血清TIgE水平升高相关;IL-17F 7488T/C多态性位点是贵阳地区哮喘的重要候选基因;C等位基因可能对哮喘有弱保护作用;该位点多态性不影响血清TIgE水平的变化.
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免疫遗传背景差异对裸鼠成瘤性影响的研究
目的 探讨不同免疫遗传背景对裸鼠成瘤性的影响.方法 按照中国药典细胞成瘤性检测方法要求,对A、B两实验室裸鼠均作阴阳对照组处理,取脏器组织进行病理学分析;采集眼球血,应用流式技术分析相应的免疫指标;并分别提取鼠尾DNA用23对微卫星引物,对2群体进行微卫星分型.结果 B实验室阳性对照不成立(出瘤7/10).两实验室裸鼠病理检测无明显差异. A、B两实验室裸鼠在CD25、CD8、CD4、Th1、Th2五项免疫指标存在差异,分别检出13和18个多态位点.进一步对B实验室3 个未出瘤个体进行比对,发现其免疫指标 CD25、Th2 和遗传标记 D3Mit29、D5Mit48表现出高值与特征性带型.结论 裸鼠免疫遗传背景差异与裸鼠成瘤性之间可能存在一定关联.
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衣原体呼吸道感染早期IL-17对调节性T细胞及其IL-10分泌的影响
目的 探讨IL-17在沙眼衣原体呼吸道感染中对调节性T细胞的影响.方法 鼻滴给予野生型(WT,C57BL/6)小鼠和 IL-17-/-小鼠 1×103包涵体形成单位(IFU)的鼠型衣原体(Chlamydia muridarum, Cm),构建小鼠衣原体呼吸道感染模型.制备小鼠脾、肺组织单个核细胞悬液,运用流式细胞术检测调节性T细胞(Treg)百分率;利用RT-PCR技术检测小鼠肺组织中Foxp3和TGF-β的mRNA表达水平;用ELISA方法检测小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-10的产生.结果 衣原体呼吸道感染第3天,IL-17--小鼠脾、肺组织中的CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例均高于WT小鼠;IL-17-/-小鼠肺组织Foxp3 mRNA表达及支气管肺泡灌洗液中IL-10的分泌显著高于WT小鼠;两种小鼠肺组织TGF-β mRNA表达无显著差异.结论 衣原体呼吸道感染早期阶段IL-17可能抑制小鼠调节性T细胞的增殖和IL-10的产生.
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问号钩端螺旋体感染对内皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染对内皮细胞表面细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响及差异.方法 采用问号钩体赖株体外感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后运用real-time RT-PCR技术检测细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平.采用组织镀银染色法检测问号钩体感染C3H/HeJ小鼠后肺、肝、肾组织内钩体侵袭情况.采用免疫组化法检测小鼠肺、肝、肾组织中 ICAM-1和 VCAM-1表达的差异.结果 问号钩体感染HUVEC后细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平与感染前相比均显著升高(P<0.05),且VCAM-1 mRNA表达水平显著高于ICAM-1(P<0.05).组织镀银染色结果显示在感染C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织内均出现入侵钩体.免疫组化结果显示,问号钩体感染小鼠后,肺、肝、肾组织内均出现ICAM-1和VCAM-1表达升高,但VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1(P<0.05).结论 问号钩体感染可激活内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,且VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1,从而介导特异性炎症细胞浸润至感染部位.
关键词： 问号钩端螺旋体 黏附分子 细胞间黏附分子-1 血管细胞黏附分子-1 -
体外诱导的Helios+调节性T细胞的特征分析
目的 本研究拟对体外诱导的Helios+调节性T细胞(induced Helios+regulatory T cell, Helios+iTreg)的特征进行分析,并比较其与正常人外周血固有Helios+Treg(natural Helios+Treg, Helios+nTreg)的差异.方法 采集并分选正常人外周CD4+CD25-效应性T细胞(effector T cell,Teff),体外以抗CD3/抗CD28合并IL-2及TGF-β刺激诱导Helios+iTreg生成,以外周血Helios+nTreg作为对照,通过流式细胞术和real-time PCR分别分析其表型特征Foxp3+Treg特异性去甲基化区(Treg-specific demethylated region,TSDR)的甲基化水平.结果 体外诱导的Helios+iTreg高表达CD45RA,而Helios+nTreg几乎不表达CD45RA;体外诱导的Helios+iTreg较Helios+nTreg CD127、ICOS和PD-1的水平明显升高,IL-2和IFN-γ的表达水平明显升高,但CXCR3、CCR4等趋化因子受体的水平则明显下降;另外CD25的表达水平也明显下降;诱导型Helios+iTreg TSDR的甲基化水平明显低于Helios+nTreg.结论 诱导型Helios+iTreg具有与Helios+nTreg不同的特征,提示其在生理及病理条件下可能发挥不同的免疫调节作用.
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刺苋花粉泛过敏原Profilin的抗原性评估与三级结构分析
目的 克隆刺苋花粉中Profilin蛋白基因,分析同源序列中不同性质氨基酸对抗原性及j级结构的贡献.方法 基于生物信息学分析已知泛过敏原Profilin的氨基酸序列并获得核心代表序列,以之为基础设计合成引物,采用Touchdown PCR技术从刺苋花粉的cDNA池中进行基因克隆,并经菌落PCR和双酶切验证;采用生物信息学软件MULTIPRED及SWISS-MODEL在线软件对所得基因编码蛋白进行抗原性评估及三级结构模拟.结果 从刺苋中获得两个序列不同的泛过敏原基因,分别命名为PRF7和PRF23.蛋白质三级结构显示:PRF7与已知的泛过敏原Profilin存在少数氨基酸的筹异,其空间结构与抗原性没有明显变化;而PRF23与北方豚草花粉泛过敏原Q64LH0之间相似程度较低,而空间结构也呈现明显的筹异;尽管Q64LH0与PRF23的伞序列抗原性均值差异无统计学意义,受一些区段上不同性质的氨基酸改变的影响,PRF23在这些区段上的抗原性显著低于Q64L-HO的抗原性.结论 基于Q64LHO和PRF23同源氨基酸序列的抗原性评估及三级结构分析,获得了不同性质氨基酸对抗原性及三级结构的贡献等信息,映射了南方花粉过敏症发牛率较低的原因所在,也为过敏原遗传改良过程中进行氨基酸置换指明了方向.
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云南汉族系统性红斑狼疮与HLA-B等位基因相关性的研究
人白细胞抗原(HLA)系统是人类为复杂的免疫遗传系统,与许多免疫疾病的发生直接或者间接相关.系统性红斑狼疮(SLE)与HLA的相关性研究一直受到国内外的关注,目前,国内研究SLE与HLA关联的报道多见于DQ、DR和TNF等基因[1-3].我们应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法对云南汉族SLE与HLA-B基因的相关性进行了研究.
