斯普林改善晚期恶性肿瘤全身状况的疗效观察
摘要： 我国癌症发病率近年呈上升趋势[1],贵州处于少数民族地区,经济文化相对落后,许多病人就诊时已是晚期,全身功能状况极差,失去了手术及放化疗机会.我科于2002～2004年对住院治疗的88例晚期肿瘤病人进行了斯普林与参麦注射液对照治疗观察,结果显示斯普林对晚期癌症病人全身状况改善方面有较好的辅助疗效,现报告如下.
-
沉默GRHL2基因表达对结直肠癌细胞增殖及细胞周期的影响
目的:研究粒状头样2(grainyhead like 2,GRHL2)基因在结直肠癌组织和细胞中的表达情况,以及沉默GRHL2基因表达对结直肠癌细胞增殖和细胞周期的影响.方法:采用实时荧光定量PCR法检测人结直肠癌和癌旁组织以及结直肠癌HT29、SW480、SW1116、SW620、HCT116、Caco2和LoVo细胞中GRHL2 mRNA的表达水平.采用慢病毒感染的方法将携带有GRHL2-shRNA的重组慢病毒转入HT29和HCT116细胞;随后,分别采用CCK-8法和细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力,FCM法检测细胞周期的变化,蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin D1、p21和p27的表达水平.建立结直肠癌HT29和HCT116细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默G RHL2基因表达对结直肠癌细胞皮下移植瘤生长的影响.结果:GRHL2mRNA在结直肠癌组织中的表达水平显著升高,其mRNA的平均表达水平是癌旁正常组织的2.8倍(P＜0.001),结直肠癌HT29、SW480、HCT116、Caco2和LoVo细胞中GRHL2 mRNA的表达水平均较高.转入GRHL2-shRNA后,HT29和HCT116细胞中GRHL2 mRNA和蛋白的表达水平明显下调(P值均＜ 0.001).沉默GRHL2基因能明显抑制结直肠癌HT29和HCT116细胞的增殖能力(P值均＜0.05),导致细胞阻滞在G1期(P值均＜ 0.01);细胞周期相关蛋白cyclin A和cyclin D1的表达水平明显下调(P＜0.05和P＜0.01),p21和p27的表达水平则明显增加(P＜0.01和P＜0.05).体内实验结果提示,沉默GRHL2基因表达能够显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长.结论:GRHL2基因可以通过调控细胞周期相关蛋白的表达而促进结肠癌细胞的增殖.
-
羟基红花黄色素A通过PI3K通路抑制人肝癌细胞增殖、迁移并促进其凋亡
目的:探讨羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)对人肝癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响,并判断是否通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号通路发挥作用.方法:HSYA和PI3K抑制剂LY294002处理人肝癌HepG2、Hep3B和SMMC7721细胞后,分别采用CCK-8法、克隆形成实验和划痕愈合实验检测细胞增殖、克隆形成和迁移能力.FCM法检测HSYA和LY294002对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,蛋白质印迹法检测HSYA和LY294002对人肝癌HepG2细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein 2,MMP2)、caspase 3、cleaved-caspase 3和磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)蛋白表达的影响.结果:50 μ mol/L HSYA和10 u mol/L LY294002均可抑制人肝癌HepG2、Hep3B和SMMC7721细胞的增殖(P值均＜0.05).50 μ mol/L HSYA、10 u mol/L LY294002和50 u mol/L HSYA联合10 u mol/L LY294002处理组HepG2、Hep3B和SMMC7721细胞克隆形成率和迁移率均低于未处理的对照组(P值均＜ 0.05),HSYA联合LY294002处理组HepG2、Hep3B和SMMC7721细胞克隆形成率和迁移率低于HSYA和LY294002单独处理组(P值均＜ 0.01).HSYA、LY294002和HSYA联合LY294002处理组HepG2细胞凋亡率均高于未处理的对照组(P值均＜0.05),HSYA联合LY294002处理组HepG2细胞凋亡率高于HSYA和LY294002单独处理组(P值均＜ 0.01).HSYA、LY294002和HSYA联合LY294002处理组HepG2细胞中p-Akt、MMP2和caspase 3蛋白表达水平均低于未处理的对照组(P值均＜0.01),cleaved-caspase 3蛋白表达水平高于未处理的对照组(P＜0.01),HSYA联合LY294002处理组的效果均好于HSYA和LY294002单独处理组(P值均＜0.01).结论:HSYA可以抑制肝癌HepG2、Hep3B和SMMC7721细胞的增殖和迁移,并可促进HepG2细胞凋亡.HSYA可能通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡.
-
沉默CITED1基因对甲状腺乳头状癌K1细胞生物学特性的影响
目的:探讨沉默CITED1 (Cbp/p300 interacting transactivator with Glu/Asp rich carboxy-terminal domain 1)基因表达对甲状腺乳头状癌K1细胞增殖、凋亡和迁移等生物学行为的影响.方法:将携带特异性靶向CITED1基因的shRNA(CITED 1-shRNA)及其阴性对照shRNA(negative control-shRNA,NC-shRNA)的重组慢病毒分别感染甲状腺乳头状癌K1细胞株,采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测CITED1基因沉默效率;然后采用CCK-8法检测细胞增殖,FCM法检测细胞周期和细胞凋亡,划痕愈合实验检测细胞迁移能力.结果:经携带CITED1-shRNA的重组慢病毒感染后,甲状腺乳头状癌K1细胞中CITED1 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P值均＜0.01),证明成功获得了CITED1基因沉默的K1细胞株.沉默CITED1基因表达后,K1细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),细胞凋亡率明显升高(P=0.001),Go/G1期细胞所占比例明显增高(P=0.007),GJM及S期细胞所占比例均明显降低(P值均＜ 0.05),而且12 h和24 h时细胞迁移能力明显减弱(P值均＜0.01).结论:沉默CITED1基因表达可以抑制甲状腺乳头状癌K1细胞的增殖和迁移,促进肿瘤细胞凋亡.
-
PCDH10在非小细胞肺癌中的表达及PCDH10过表达对A549细胞功能的影响
目的:探讨原钙黏蛋白10 (protocadherin 10,PCDH10)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达情况,并探讨其在NSCLC细胞中的生物学功能及可能的分子作用机制.方法:采用实时荧光定量PCR法检测PCDH10及Ki67 mRNA在NSCLC及相应癌旁组织中的表达水平,并分析其表达与临床病理特征及预后之间的关系.采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-PCDH10及空载体pcDNA3.1(+)转入肺腺癌A549细胞;然后,采用IncuCyte S3活细胞动态与分析系统检测细胞的增殖能力,FCM法检测细胞周期与凋亡水平,Transwell小室法检测细胞的迁移及侵袭能力.后,采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及Slug mRNA和蛋白的表达水平.结果:PCDH10 mRNA在NSCLC组织中的表达水平明显低于其在癌旁组织中的表达水平(P＜0.001);PCDH10 mRNA的表达与NSCLC的T分期、淋巴结转移、TNM分期及Ki67 mRNA表达负相关(P值均＜0.001),与患者预后正相关(P＜0.001).PCDH10过表达可通过诱导A549细胞发生G1期阻滞及促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖(P值均＜0.05),并能抑制A549细胞的迁移及侵袭能力(P值均＜0.01);PCDH10过表达A549细胞中PCNA、Bcl-2、cyclin D1、cyclin E、CDK4和Slug mRNA及蛋白的表达水平均较空载体对照组明显下调(P值均＜0.05),仅有E-cadherin mRNA及蛋白的表达水平明显上调(P值均＜0.01).结论:PCDH10在NSCLC组织中低表达,PCDH10过表达可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭.
-
二甲双胍通过诱导大鼠泌乳素瘤MMQ细胞发生自噬而促进细胞凋亡
目的 :探讨自噬在二甲双胍诱导的垂体泌乳素瘤细胞凋亡中的作用.方法 :用不同浓度的二甲双胍处理泌乳素瘤MMQ细胞不同时间后, CCK-8法检测细胞增殖, FCM法检测细胞凋亡, 透射电子显微镜检测细胞中自噬溶酶体的形态及数量变化.用二甲双胍和 (或) 自噬抑制剂3-甲基腺苷 (3-methyladenine, 3-MA) 处理MMQ细胞后, 蛋白质印迹法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, m TOR) -自噬-凋亡信号通路相关蛋白的表达.结果:二甲双胍明显抑制MMQ细胞增殖, 并诱导细胞凋亡 (P值均＜0.05) .二甲双胍能够诱导MMQ细胞自噬, 使细胞中的自噬小体数量明显增加 (P＜0.001);而自噬抑制剂3-MA处理可显著抑制二甲双胍诱导的细胞自噬和凋亡相关蛋白微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein light chain 3, LC3) -Ⅱ、Beclin 1和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly (ADP-ribose) polymerase, PARP]表达 (P值均＜0.05) .二甲双胍明显抑制MMQ细胞中mTOR及其下游蛋白P70核糖体蛋白S6激酶 (P70 ribosomal protein S6 kinase, P70S6K) 和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白 (eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1, 4EBP1) 的表达活性 (P值均＜0.05) .结论:二甲双胍可能通过下调mTOR活性, 诱导细胞自噬, 从而促进垂体泌乳素瘤细胞发生凋亡.
关键词： 催乳素瘤 二甲双胍 mTOR丝氨酸-苏氨酸激酶 自噬 -
肺岩宁下调肺癌侧群细胞含量及其选择性抑癌机制
目的 :探讨中药复方肺岩宁对肺癌侧群 (side population, SP) 细胞的影响及其可能的作用机制.方法:采用CCK-8法检测0、50、100、200、300、400、500μg/mL肺岩宁和0、1、2、3、4、5、6、7μg/mL顺铂分别处理24、48和72 h后肺癌A549细胞的增殖情况.采用FCM法检测200μg/mL肺岩宁、3μg/mL顺铂和二者联合对A549细胞凋亡的影响, 以及100、200、300、400、500μg/mL肺岩宁和3μg/mL顺铂对A549细胞中SP细胞含量的影响.采用蛋白质印迹法检测SP细胞和非SP细胞中ATP结合盒转运蛋白G亚家族成员2 (ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2, ABCG2) 蛋白的表达水平, 同时检测200μg/mL肺岩宁和3μg/mL顺铂对SP细胞中ABCG2蛋白表达的影响.结果:肺岩宁 (50～500μg/mL) 和顺铂 (1～7μg/mL) 都能够抑制肺癌A549细胞的增殖, 并呈剂量和时间依赖性 (P值均＜0.05) .200μg/mL肺岩宁能诱导A549细胞凋亡 (P＜0.01), 但其凋亡率低于3μg/mL顺铂组 (P＜0.01), 而肺岩宁联合顺铂组的促凋亡作用较单独顺铂组更显著 (P＜0.05) .100～500μg/mL肺岩宁能下调A549细胞中SP亚群的含量, 并呈剂量依赖性 (P值均＜0.01) .SP细胞中ABCG2蛋白表达水平明显高于非SP细胞 (P＜0.01), 而200μg/mL肺岩宁能明显下调SP细胞中ABCG2蛋白的表达 (P＜0.01) .结论:肺岩宁能抑制肺癌细胞增殖, 诱导其凋亡.而且肺岩宁可下调肺癌细胞中SP细胞的含量, 这一作用可能与抑制ABCG2蛋白表达有关.
-
乳腺癌细胞通过上调Ambra1表达诱导自噬降低对表柔比星的敏感性
目的 :研究Ambra1 (autophagy/Beclin 1 regulator 1, Ambra1) 蛋白表达与表柔比星 (epirubicin, EPI) 诱导产生的乳腺癌耐药细胞中自噬的相关性, 并探讨其可能的作用机制.方法:通过剂量递增法诱导建立对EPI耐药的乳腺癌MDA-MB-231er、SKBR3er和MCF-7er细胞.CCK-8法检测EPI对亲本细胞MDAMB-231、SKBR3和MCF-7以及诱导获得的耐药细胞的半数抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration, IC50), 蛋白质印迹法检测Ambra1蛋白在亲本和耐药细胞中的表达水平, 荧光显微镜下观察亲本和耐药细胞中稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhanced greenuorescent protein, EGFP) -轻链3 (light chain 3, LC3) 融合蛋白自噬泡数的变化, 以及蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白的表达水平.采用特异性针对Ambra 1基因的shRNA (Ambra1-shRNA-2450和Ambra1-shRNA-3388) 沉默耐药细胞中Ambra1的表达水平, 再用EPI处理Ambra 1基因沉默后的耐药细胞, 通过检测细胞的自噬、存活率及凋亡率, 进一步研究Ambra1蛋白表达与EPI诱导自噬的关系, 以及对EPI敏感性的影响.结果:诱导建立对EPI耐药的MDA-MB-231er、SKBR3er和MCF-7er细胞, 3株耐药细胞的IC50值均明显高于各自的亲本细胞 (P值均＜0.05) .与亲本细胞相比, 耐药细胞中Ambra1蛋白的表达水平明显升高 (P值均＜0.05), 耐药细胞的自噬活性也明显提高 (P值均＜0.05) .Ambra 1基因沉默后, 显著降低了EPI诱导的耐药细胞的自噬能力, 同时明显降低了耐药细胞的存活率, 提高了细胞的凋亡率 (P值均＜0.05) .结论:Ambra1蛋白通过促使自噬发生, 诱导乳腺癌细胞对EPI的耐药.
-
PLCε沉默后通过Wnt/β-catenin信号通路抑制比卡鲁胺耐药的前列腺癌细胞增殖
目的:探讨磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cε (phosphoinositide-speci c phospholipase Cε, PLCε) 对前列腺癌细胞增殖和比卡鲁胺敏感性的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用.方法:采用比卡鲁胺浓度递增及间歇诱导法建立对比卡鲁胺耐药的前列腺癌B-LNCAP细胞.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测前列腺癌LNCAP和B-LNCAP细胞中雄激素受体 (androgen receptor, AR) 和PLCεmRNA和蛋白的表达, CCK-8法检测LNCAP和B-LNCAP细胞对比卡鲁胺的敏感性.将干扰PLCε表达的重组慢病毒LV-shPLCε或阴性对照 (negative control, NC) LV-NC感染B-LNCAP细胞 (称为LVshPLCε/B-LNCAP或LV-NC/B-LNCAP), Wnt/β-catenin信号通路激活剂AZD2858处理LV-shPLCε/B-LNCAP细胞, 以未进行任何干预的B-LNCAP细胞作为空白组.应用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况及对比卡鲁胺的敏感性, 应用克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力, 蛋白质印迹法检测各组细胞的细胞质和细胞核中β-catenin和AR蛋白表达水平, 实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中c-myc、cyclin D1mRNA和蛋白表达水平.结果:B-LNCAP细胞中PLCε、AR mRNA和蛋白的表达水平均高于LNCAP细胞 (P值均＜0.05), B-LNCAP细胞对比卡鲁胺的耐药系数为132.87, 成功构建前列腺癌耐药细胞B-LNCAP.LV-shPLCε/B-LNCAP细胞增殖和克隆形成能力均弱于空白组和LV-NC/B-LNCAP组 (P值均＜0.01), 比卡鲁胺对LV-shPLCε/B-LNCAP细胞的半数抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration, IC50) 值均低于空白组和LV-NC/B-LNCAP组 (P值均＜0.05), LV-shPLCε/B-LNCAP细胞核中β-catenin和AR蛋白表达水平明显低于空白组和LV-NC/B-LNCAP组 (P值均＜0.01), LVshPLCε/B-LNCAP细胞中c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达水平均低于空白组和LV-NC/B-LNCAP组 (P值均＜0.01);AZD2858处理的LVshPLCε/B-LNCAP细胞增殖和克隆形成能力强于LV-shPLCε/B-LNCAP细胞 (P值均＜0.05), 比卡鲁胺对AZD2858处理的LV-shPLCε/B-LNCAP细胞IC50值高于未处理的LV-shPLCε/B-LNCAP细胞 (P＜0.05), AZD2858处理的LV-shPLCε/B-LNCAP细胞核中β-catenin和AR蛋白表达水平均高于LV-shPLCε/B-LNCAP细胞 (P值均＜0.05), AZD2858处理的LV-shPLCε/B-LNCAP细胞中c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均高于LV-shPLCε/B-LNCAP细胞 (P值均＜0.05) .结论:PLCε下调后通过抑制Wnt/β-catenin信号通路, 增强前列腺癌B-LNCAP细胞对比卡鲁胺的敏感性, 抑制前列腺癌B-LNCAP细胞的增殖.
-
PI3Kδ抑制剂促进CD8+T细胞在乳腺癌移植瘤中浸润
目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶δ亚型 (phosphatidylinositol 3-kinase delta, PI3Kδ) 抑制剂PI-3065对免疫健全小鼠体内乳腺癌生长的抑制作用及其可能的分子机制, 并初步了解其不良反应.方法:对免疫健全的乳腺癌移植瘤小鼠给予大剂量PI-3065 (75 mg/kg) 治疗, 观察小鼠内脏变化.调整剂量并随机分为低剂量组 (18.75 mg/kg) 、高剂量组 (37.5 mg/kg) 和溶剂处理对照组, 每日灌胃给药, 每周测量肿瘤体积2次.HE染色法检测小鼠体内各实质脏器和肿瘤组织的病理学变化.免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD8+T细胞的含量.CellTrace.Violet细胞增殖试剂盒和FCM法分别检测CD8+T细胞增殖活性和细胞表型的变化.结果:75 mg/kg PI-3065可造成小鼠肝脏肿大 (P＜0.01) .调整PI-3065剂量后, 37.5 mg/kg剂量组小鼠体内肿瘤生长受到明显抑制 (P＜0.05), 而小鼠饮食、精神、活动、排泄和体质量 (P＞0.05) 无明显变化, 各脏器组织均未发现明显病变, 而肿瘤组织中CD8+T细胞浸润水平明显上调 (P＜0.01) .PI-3065不影响CD8+T细胞增殖 (P＞0.05), 但可以下调细胞中程序性死亡分子1 (programmed death-1, PD-1) 、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3 (T cell immunoglobulin and mucin-3, TIM-3) 和淋巴细胞活化基因3 (lymphocyte-activation gene-3, LAG-3) 的表达 (P值均＜0.05), 抑制CD8+T细胞衰竭.结论:大剂量PI-3065会造成肝脏肿大, 而适当剂量的PI-3065处理可抑制小鼠体内乳腺癌移植瘤的生长;其机制与抑制CD8+T细胞衰竭并上调肿瘤中CD8+T细胞浸润水平有关.
-
联合沉默HER2和TFF3基因表达抑制胃癌NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭
目的 :探讨沉默人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER 2) 基因对人胃癌NCI-N87细胞中三叶因子3 (trefoil factor 3, TFF3) 表达的影响, 并探讨联合抑制HER2和TFF3表达对NCI-N87细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法:通过CCLE (Cancer Cell Line Encyclopedia) 数据库获取38株不同胃癌细胞株中HER2与TFF3 mRNA的表达水平并分析其相关性.采用脂质体法将特异性针对HER 2基因的siRNA以及过表达质粒转染至人胃癌NCI-N87细胞中, 应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法分别检测转染HER2-siRNA和HER2过表达质粒后NCI-N87细胞中HER2 mRNA和蛋白的表达水平, 以及TFF3 mRNA与蛋白表达水平的变化;采用CCK-8法和Transwell小室法分别检测单独以及联合转染HER2-siRNA和TFF3-siRNA对NCI-N87细胞增殖、迁移和侵袭的影响.结果:38种不同胃癌细胞株中HER2和TFF3 mRNA的表达水平呈负相关性 (γ=-0.24, P=0.049);转染HER2-siRNA后, 与阴性对照组相比, NCI-N87细胞中HER2 mRNA和蛋白表达水平均明显下调 (P值均＜0.05), 而TFF3 mRNA和蛋白表达水平随之出现上调 (P值均＜0.05);转染HER 2基因过表达质粒后, NCI-N87细胞中HER2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调 (P值均＜0.05), TFF3 mRNA和蛋白水平则呈下降的趋势, 但差异无统计学意义 (P值均＞0.05);联合转染HER2-siRNA和TFF3-siRNA较单独转染HER2-siRNA或TFF3-siRNA能更显著地抑制NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭 (P值均＜0.05) .结论:HER2与TFF3在不同胃癌细胞株中的表达呈负相关性;沉默HER 2基因表达能诱导NCI-N87细胞中TFF3表达水平上调;联合拮抗HER2和TFF3的表达能够协同抑制NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭.
