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Nec-1对铝致神经细胞凋亡和自噬的作用
目的 观察和探讨在铝致神经细胞死亡中,坏死抑制剂1(Nec-1)对凋亡和自噬的作用.方法 用体外原代培养小鼠神经细胞的方法,制造铝损伤神经细胞模型,然后用细胞活力检测、荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(Western-Blot)以及流式细胞术等方法从多角度对Nec-1的作用进行研究.结果 ①流式结果显示,在Al3+(2 mmol/L)作用于神经细胞后,随着Nec-1剂量的增加,细胞的凋亡率呈下降趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);②qRT-PCR结果显示,以Al3+(2 mmol/L)为对照,Nec-1(60和90 μmol/L)可使神经细胞的凋亡和自噬相关基因的表达呈显著性下降(P<0.05);③Western-Blot结果显示,同Al3+(2 mmol/L)组比,Nec-1(60和90 μmol/L)组凋亡相关蛋白caspase-3的表达下降(P<0.01),Nec-1(30和60 μmol/L)可使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达下降(P<0.05).结论 在本试验条件下,Nec-1可减少铝导致的神经细胞凋亡和自噬,起到保护神经细胞的作用.
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Nec-1在小鼠脑出血中通过抑制程序性坏死发挥神经保护作用
目的 研究程序性坏死的特异性抑制剂Nec-1对小鼠脑出血神经功能的保护作用,并探讨其机制.方法 选取健康雄性ICR小鼠,体重25～ 30 g,采用在纹状体部位注射胶原酶Ⅳ或生理盐水的方法建立小鼠脑出血组或者脑出血对照组,在脑出血前15 min分别在侧脑室注射Nec-1溶液或vehicle溶液.将实验随机分为:对照组、脑出血+ vehicle处理组、脑出血+Nec-1处理组.分别利用干湿重法测定脑水肿程度,神经功能评分检测神经运动功能,Western blotting检测cleaved caspase-3,Bcl-2蛋白表达情况.结果 脑出血加剧脑水肿程度,而Nec-1处理组减轻脑水肿程度(P＜0.05).经Nec-1处理后,可以提高小鼠脑出血神经运动功能(P＜0.05).脑出血可以增加cleaved caspase-3蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达,经Nec-1处理后,抑制cleaved caspase-3的表达水平(P＜0.05),增加Bcl-2的表达(P＜0.05).结论 Nec-1对脑出血发挥重要神经保护作用,这种保护作用可能是通过抑制凋亡通路实现的,提示程序性坏死在脑出血中具有重要作用,将为脑出血的治疗提供新的思路.
关键词： Nec-1 脑出血 程序性坏死 Cleaved Caspase-3 Bcl-2 -
RIP1/RIP3通路介导谷氨酸诱导的HT-22海马神经细胞损伤的体外研究
目的 探讨受体相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP3通路是否介导谷氨酸诱导的HT-22海马神经细胞死亡. 方法 (1)体外培养小鼠海马神经细胞株HT-22,分为空白对照组、zVAD组、Nec-1组、谷氨酸组、谷氨酸+zVAD组、谷氨酸+zVAD+Nec-1组、谷氨酸+Nec-1组,zVAD、Nec-1、谷氨酸的终浓度分别为20 μmol/L、30 μmol/L、3 mmol/L,作用24 h后用Cell titer glo发光法细胞活力检测试剂盒(CTG)检测细胞存活率;碘化丙啶(PD及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死;(2)将HT-22细胞分为空白对照组、谷氨酸组、谷氨酸+Nee-1组,浓度和作用时间同上,应用MitoSox red线粒体超氧化物指示剂检测细胞线粒体内活性氧自由基(ROS)水平;(3)将HT-22细胞分为空白对照组、谷氨酸组、谷氨酸+叔丁基茴香醚(BHA)组,BHA的终浓度为100 μmol/L,作用24 h后用PI及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死;(4)将HT-22细胞分为RIP3 siRNA组、对照组,分别转染RIP3 siRNA、siRNA对照序列,72 h后Western blotting检测2组细胞RIP3蛋白的表达;(5)将HT-22细胞分为对照组、R1P3 siRNA组、谷氨酸组、RIP3 siRNA+谷氨酸组,分别各自转染siRNA对照序列、RIP3 siRNA,48 h后加入3 mmol/L谷氨酸,24 h后用PI及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死,CTG检测细胞存活率. 结果 (1)与空白对照组比较,谷氨酸组、谷氨酸+zVAD组PI阳性细胞百分比升高,细胞存活率降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与谷氨酸组比较,谷氨酸+Nec-1组PI阳性细胞百分比明显减少,细胞存活率增加,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)谷氨酸组HT-22细胞内的ROS水平明显高于空白对照组,谷氨酸+Nec-1组细胞内的ROS水平明显低于谷氨酸组,差异有统计学意义(P＜0.05);(3)谷氨酸组PI阳性细胞百分比高于空白对照组,谷氨酸+BHA组PI阳性细胞百分比低于谷氨酸组,差异有统计学意义(P＜0.05);(4)与对照组比较,RIP3siRNA组细胞内RIP3蛋白水平明显下调;(5)与对照组比较,谷氨酸组PI阳性细胞百分比升高、细胞存活率降低,与谷氨酸组比较,RIP3 siRNA+谷氨酸组阳性细胞百分比降低、细胞存活率升高,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 RIP1、RIP3通路及ROS介导谷氨酸诱导的HT-22海马神经细胞死亡.
关键词： 谷氨酸 程序性坏死 Nec-1 受体相互作用蛋白激酶1/3 HT-22
