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煤焦沥青提取物对BEAS-2B细胞Keap1-Nrf2/ARE通路的作用机制
目的 研究煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2、Keap1、NQO1的基因及其蛋白表达的影响,以探讨煤焦沥青烟提取物在造成细胞氧化损伤过程中Nrf2-Keap1/ARE通路的作用机制.方法 设立未处理对照组、0.1％DMSO溶剂对照组、5μg/ml B(a)P阳性对照组、6μmol/L全反式维甲酸组、6μmol/L全反式维甲酸预处理0.5h后5 μg/ml CTP染毒组和CTP染毒组(1、5、10和20 μg/ml),染毒3、6、12和24 h后提取总RNA；RT-PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的相对表达量;Western blot测定Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的相对表达量.结果 不同CTP染毒剂量作用后各个基因mRNA相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05),而不同时间点相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,随着CTP烟提取物染毒浓度的增加,Keap1蛋白无明显变化,NQO1蛋白表达量逐渐上升;Nrf2蛋白在5 μg/ml染毒浓度时表达高,在5μg/ml CTP染毒浓度作用下,BEAS-2B细胞Nrf2蛋白表达量随时间逐渐升高,在染毒6h后达到高,之后表达量又呈下降趋势.结论 煤焦沥青烟提取物作用于BEAS-2B细胞后,代谢酶NQO1表达上调,推测Keap1 -Nrf2/ARE通路可能通过上调细胞保护性基因NQO1的表达而对抗煤焦沥青毒性作用,降低细胞氧化损伤.
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人单核细胞对煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞TRAF2mRNA表达的影响
目的 探讨人单核细胞(THP-1)对煤焦沥青烟提取物(CTPE)诱导BEAS-2B细胞肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)mRNA表达的影响.方法 构建THP-1细胞和BEAS-2B细胞的共培养模型,用终浓度3μg/mL的CTPE处理共培养模型,细胞培养至第9代时加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)中和抗体和C-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125,继续培养至第15代(cc15),设立共培养模型CC15组、TNF-α中和抗体组、JNK激酶抑制剂SP600125组,同代培养的BEAS-2B细胞为对照组,用Real-time PCR方法检测各组细胞中TRAF2 mRNA的相对表达水平.结果 与CC10组相比,TNF-α中和抗体对共培养细胞作用不同时间时TRAF2 mRNA的相对表达量均降低(P ＜0.001),作用48 h时TRAF2 mRNA相对表达水平达到低(0.19 ±0.02).SP600125抑制剂作用共培养细胞不同时间时c-Jun mRNA的相对表达水平与CC10组相比差异均有统计学意义(P ＜0.001),36 h组表达水平低(0.03-±0.02).TNF-α中和抗体组和SP600125抑制剂组TRAF2 mRNA相对表达水平(分别为1.73 ±0.04和1.88 ±0.05)均高于对照组(1.07±0.06),低于CC15组(2.23±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 THP-1可通过TNF-α上调了CTPE诱导的BEAS-2B细胞中TRAF2 mRNA的表达水平,TRAF2和AP-1之间可能存在负反馈作用.
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煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究
目的 建立煤焦沥青烟提取物诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B株的恶化模型;观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系.方法用四唑蓝(MTT)法测定煤焦沥青烟提取物的细胞毒性,以煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变;软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化能力,流式细胞术检测细胞增殖周期变化,核型分析观察细胞染色体不稳定性.结果 煤焦沥青烟提取物的半数致死浓度(LC50)为8.64 mg/L.以诱导剂量(2.0 mg/L)诱导细胞转化,经过30代传代培养,细胞形态发生恶性变化.第30代时,诱导组细胞即能在软琼脂上形成阳性克隆,细胞克隆形成率为21.50‰,明显高于正常对照组和溶剂对照组.流式细胞术检测诱导组G1期细胞比例明显减少,G2/M期细胞比例明显增加.煤焦沥青诱导组从第10代开始细胞二倍体核型的比例明显下降,非整倍体细胞的比例明显增加.随着传代次数增加,染色体不稳定性更明显.细胞克隆形成率和染色体变异的细胞百分比两者呈正相关.结论 煤焦沥青烟提取物可以在体外诱导BEAS-2B细胞产生染色体不稳定性并发生恶化.
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人单核细胞对煤焦沥青烟提取物诱导人永生化支气管上皮细胞c-Jun mRNA表达的影响
[目的]探讨人单核细胞对煤焦沥青烟提取物(CTPE)处理人永生化支气管上皮细胞中c-Jun mRNA表达的影响. [方法]用3 μg/mL CTPE刺激人永生化支气管上皮细胞(CTPE组),及人单核细胞共培养的人永生化支气管上皮细胞(CC组),设立二甲基亚砜对照组;分别收集各组1、5、10、15、20代细胞.将CC组第9代细胞分别常规培养至10代(CC10组)、15代(CC15组),加入100μg/mL肿瘤坏死因子-α中和抗体培养至15代(中和抗体组).应用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组细胞中c-Jun mRNA的表达水平. [结果]15、20代CC组人永生化支气管上皮细胞c-Jun mRNA相对表达水平高于CTPE组和二甲基亚砜对照组(均P＜0.05);中和抗体组c-Jun mRNA的相对表达水平高于CC10组,低于CC15组(均P＜0.05). [结论]人单核细胞可能通过肿瘤坏死因子-α调控CTPE诱导人永生化支气管上皮细胞c-Jun mRNA的表达.
关键词： 煤焦沥青烟提取物 c-jun mRNA 人单核细胞 肿瘤坏死因子-α -
煤焦沥青烟提取物对人支气管上皮细胞的脂质过氧化作用
[目的]研究煤焦沥青烟提取物(CTPE)刺激人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的脂质过氧化作用. [方法]用不同浓度(0、1、3μg//mL)的CTPE刺激BEAS-2B细胞4h后,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平.刺激BEAS-2B细胞8h后,用丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)活力测定试剂盒分别检测细胞裂解液中的MDA含量和SOD活力. [结果]与对照组相比,CTPE(1、3μg/mL)作用细胞4h后,ROS含量均显著升高(P＜0.05).1、3μg/mL CTPE刺激细胞8h后,MDA含量均升高,SOD活力均明显降低(P＜0.05); MDMSOD值升高(P＜0.05). [结论]煤焦沥青烟提取物刺激BEAS-2B细胞后ROS水平和MDA含量增高,SOD活力降低,发生了脂质过氧化作用.
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RNAi沉默Nrf2基因增强煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞的毒性作用
目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Nrf2基因对煤焦沥青烟提取物(CTPE)致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化过程中的作用,为肺癌的发生机制提供线索.方法:应用RNAi技术建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株;设立二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、苯并(a)芘[B(a)P]阳性对照组、CTPE组、RNAi组;采用软琼脂克隆形成实验分析细胞恶变情况;采用RT-PCR法检测Nrf2和NQO1 mRNA的表达;Western blot法检测Nrf2和NQO1蛋白的表达.结果:20代以后,B(a)P组、CTPE组和RNAi组的克隆形成率高于DMSO组(P＜0.001);而RNAi组的克隆形成率高于B(a)P组和CTPE组(P＜0.001).B(a)P组和CTPE组Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均较DMSO组增加(P ＜0.001),B(a)P组、CTPE组和RNAi组NQO1 mRNA和蛋白水平均较DMSO组上调,RNAi组的表达量低于B(a)P组和CTPE组(P ＜0.001);诱导后(CTPE组)第10代、20代、30代细胞中Nrf2与NQO1的蛋白表达呈正相关(r=0.913,P＜0.001).结论:Nrf2可能通过上调NQO1的表达对抗CTPE对BEAS-2B细胞的毒性作用从而抑制细胞恶化;Nrf2和NQO1在BEAS-2B细胞癌前病变阶段已呈现较明显表达,这可能有助于接触CTPE高危人群罹患肺癌的预警及筛查.
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煤焦沥青烟提取物对 BEAS-2 B细胞环氧化酶-2 mRNA 表达的影响
目的：探讨煤焦沥青烟提取物（ CTPE）对人支气管上皮细胞环氧化酶-2（ COX-2） mRNA表达的影响。方法：应用RT-PCR方法测定不同质量浓度（2、4、8 mg/L）CTPE作用不同时间（2、4、8 h）对人支气管上皮BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达水平影响。使用放线菌素（Act）D（1 mg/L）作用于BEAS-2B细胞，观察其对2 mg/L CTPE作用30 min后的BEAS-2B细胞COX-2基因转录的影响。利用ZnSO4溶液刺激BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达，去除ZnSO4后，加入1 mg/L的Act D 30 min，检测CTPE 作用不同时间点（0、2、4 h）的COX-2 mRNA表达的变化。结果：2、4、8 mg/L CTPE刺激均可以使BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达水平升高（ F组间＝71．750，F时间＝93．120， F交互＝17．300，P＜0．001），2 mg/L是佳剂量。用Act D（1 mg/L）预处理细胞30 min，可降低CTPE对COX-2 mR-NA表达的诱导作用（FAct D ＝174．203，FCTPE ＝260．312，F交互＝188．521，P＜0．001）。使用ZnSO4刺激，然后使用Act D终止COX-2 mRNA合成后，不同时间点， CTPE 组和对照组COX-2 mRNA的表达差异有统计学意义（ F组间＝365．700，F时间＝37．780， F交互＝6．240，P＜0．001）。结论：CTPE可以通过转录水平和转录后水平诱导人支气管上皮细胞COX-2 mRNA的表达。
