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锰致大鼠多巴胺能神经细胞DA分泌减少效应中PARK2基因的调控作用
目的 研究锰对经RNA沉默PARK2基因后的多巴胺(DA)能神经元细胞功能的影响.方法 用原代培养新生大鼠纹状体细胞,分3类处理组,即:单纯锰处理组、慢病毒对照组和慢病毒PARK2 SiRNA干扰处理组.各处理组均用不同浓度锰(0、300和500μmol/L)处理,分别用qPCR检测PARK2表达,Western blot检测Parkin,ELISA法检测细胞分泌的DA水平.结果 在各处理组中:与0μmol/L相比较300和500 μmol/L染锰组PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均下降,差异有统计学意义(P＜0.05);单纯染锰处理组及慢病毒对照组与PARK2 SiRNA干扰处理组比较,相同染锰剂量的PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);单纯染锰处理组与慢病毒对照组比较,相同染锰剂量的PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 对大鼠多巴胺(DA)能神经元细胞进行PARK2RNA干扰后再染锰,可加重其DA分泌量的降低,锰暴露作用下DA能神经元的功能与PARK2的改变相关.
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PARK2基因在锰致大鼠运动功能降低中的作用
目的 研究PARK2基因在锰致大鼠运动功能降低中的作用.方法 将30只SPF级SD雄性大鼠随机分成3组,每组10只.对照组:注射用生理盐水;低剂量组:Mn2+1 mg/kg,换算成MnCl2·4H20为3.6 mg/kg;高剂量组:Mn2+5 mg/kg,换算成MnCl2·4H20为18 mg/kg.适应性喂养1周,通过腹腔注射染锰,1次/2 d,监测体重.通过体重变化的结果分析锰中毒对大鼠体重的影响;转棒实验检测大鼠运动协调能力;Y迷宫检测大鼠学习记忆能力;RT-PCR测定血液、纹状体、皮质内PARK2基因的表达,TH免疫组化染色观察染锰后雄性大鼠纹状体及黑质的病理改变.结果 随着染锰剂量的增加大鼠体重增长明显减慢.对照组和高剂量组比较在转棒实验中总路程和总时间以及平均速度均有明显差异,对照组转动时间和路程明显长于染锰组,差异有统计学意义(P＜0.05).各组Y迷宫交替率差异无统计学意义.染锰组与对照组比较,全血、纹状体和皮质内PARK2的表达明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).光学显微镜下,TH免疫组化染色可见对照组黑质致密带的多巴胺能神经元数量较多,呈带状斜行排列,高剂量染锰组多巴胺能神经元几乎消失,残存神经元萎缩.结论 锰对大鼠运动功能有一定影响,PARK2基因在对抗锰中毒大鼠模型的神经毒性中发挥了保护作用.
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锰神经毒性作用与PARK2研究进展
锰是人体代谢过程中不可缺少的微量元素，长期接触锰会导致慢性锰中毒，其神经毒性确切机制尚不明确。 PARK2近年来作为帕金森研究热点之一，主要研究两者之间关系。本文就锰引起多巴胺损伤、氧化应激损伤、线粒体损伤等方面和PARK2与帕金森之间关系进行研究，探索其毒性作用机制与PARK2新进展。
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广西壮族人群散发性帕金森病PARK2和LRRK2基因的多态性
目的：探讨帕金森病蛋白（ PARK）2和富亮氨酸重复激酶（ LRRK）2基因5个位点的单核苷酸多态性（ SNP）与广西壮族人群散发性帕金森病（PD）的相关性。方法使用聚合酶链反应－限制性片段长度多态（PCR－RFLP）方法对112例〔男59例，女53例，年龄（64．29±12．93）岁〕壮族散发性PD患者 PARK2基因的 rs1801582（V380L）、rs45530340（L63V）及 LRRK2基因的 rs34778348（G2385R）、rs1491942（N511K）、rs7133914（R1398H）位点进行基因分型，并与156例〔男84例，女72例，年龄（62．85±11．62）岁〕健康壮族老年人比较，分析这些变异与PD的相关性。结果SNP rs45530340 T等位基因明显增加PD的风险（OR＝2．252，95％CI：1．186～3．517，P＝0．009）；不管是早发、晚发或总体上，PD组的CT杂合基因型频率及T等位基因频率均明显高于对照组的相应亚组（P＜0．01～0．05），而PD组内的早发及晚发亚组在基因型频率及等位基因频率上无明显差别（P＞0．05）；SNP rs34778348 A等位基因携带者罹患PD的风险也明显升高（OR＝1．632，95％CI：1．238～2．346，P＝0．029），总体上 PD 组等位基因 A及纯合突变型AA的频率明显高于对照组（ P＜0．05）。另3个 SNP 的基因型和等位基因频率分布在两组间无差异（ P＝0．445～0．894）。结论PARK2 rs45530340及LRRK2 rs34778348与广西地区壮族散发性PD的遗传易感性有关。
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锰致PC12细胞PARK2表达对多巴胺分泌的修饰作用
[目的]研究锰在不同剂量和不同时间下对鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)中多巴胺含量和PARK2表达的影响.[方法]鼠PC12细胞分别以(1)0、100、300、500 μmol/L浓度的氯化锰(MnCl2)染毒24h; (2)500 μmol/L MnCl2染毒6、24、48h.采用反相高效液相-荧光法测定细胞内多巴胺含量,实时荧光定量聚合酶链反应检测PARK2 mRNA水平. [结果]随着染毒浓度的增高,多巴胺含量及PARK2 mRNA表达呈下降趋势.与对照组比较,300 μmol/L或以上浓度MnCl2染毒所致多巴胺含量降低和PARK2 mRNA表达降低(P＜0.01).500 μmol/L MnCl2分别染毒6、24、48h,多巴胺含量明显降低(P＜0.01),PARK2 mRNA表达下调(P＜0.05). [结论]锰可致PC12细胞多巴胺含量减少,可能与PARK2的表达下调有关.
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脱锰后大鼠PARK2基因表达及运动和记忆功能的变化
[目的]探讨大鼠脱锰前后全血中PARK2基因表达水平的改变,及其与大鼠运动、记忆功能的关系.[方法] 60只健康成年SPF级SD大鼠(6周龄,160～180g)随机分为对照组(生理盐水)、低剂量锰组(1mg/kg)、高剂量锰组(5 mg/kg),每组20只.以5mL/kg体积大鼠腹腔注射MnCl2染锰,隔天1次,连续4周.每组随机抽取10只大鼠进行转棒和Y迷宫实验分别检测运动和记忆功能;麻醉后取全血,石墨炉原子吸收仪检测全血中锰质量浓度(后称浓度),实时荧光定量PCR检测全血中PARK22基因表达情况.各组余下大鼠停止染锰,继续常规饲养5个月后操作同前.期间每月对大鼠进行乙醚麻醉后取内眦静脉全血动态检测血液中PARK2表达变化.[结果]染锰1个月后:与对照组[(2.10士0.15)mg/L]比较,高[(5.31±0.23)mg/L]、低[(3.13±0.16)mg/L]剂量组大鼠血锰浓度增高(P＜0.05);高、低剂量组大鼠PARK2基因相对表达水平分别为6.83土1.97、13.15±3.84,均低于对照组(26.05±3.66)(P＜0.05);高剂量组大鼠转棒距离[(743.56±99.66)cm]低于对照组[(1547.09±192.53)cm](P＜0.05);大鼠全血锰浓度与转棒距离(r=-0.74)、全血PARK2表达(r=-0.57)均呈负相关(均P＜0.05),全血PARK2水平与转棒距离呈正相关(r=0.61,P=0.02).脱锰5个月后:高剂量组大鼠血锰浓度[(2.54土0.20)mg/L]较前下降(P＜0.05),但仍高于对照组[(1.80±0.09)mg/L](P＜0.05);高剂量组大鼠转棒距离为(1 105.73±132.23)cm,较染锰1个月时增加(P＜0.05).[结论]亚急性锰染毒大鼠脱锰后,全血PARK2基因相对表达水平及运动功能可恢复,PARK2基因可能作为锰致大鼠运动功能损伤的潜在标志.
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氯化锰致人骨髓神经母细胞瘤细胞株线粒体损伤及对多巴胺分泌和PARK2表达的影响
[目的]研究氯化锰对入骨髓神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)线粒体损伤、氧化应激、多巴胺分泌及PARK2表达的影响.[方法]0、100、300、500 μunol/L浓度氯化锰染毒SH-SY5Y细胞24h后,用MTT法测细胞抑制率(反映线粒体损伤情况),石墨炉原子吸收光谱法测定细胞内锰浓度,高度水溶性四唑盐(WST-1)法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,反相高效液相色谱-荧光法测定细胞内多巴胺(DA)含量,实时荧光定量-PCR检测PARK2 mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Pakin蛋白表达.[结果]与对照组比较,MnCl2浓度为300、500 μmol/L时,细胞抑制率(线粒体损伤)增高(P＜0.01).与对照组比较,染锰组细胞内锰浓度升高(P＜ 0.05或P＜0.01).与对照组比较,MnC12浓度为300、500 μmol/L时,SOD活性和DA含量降低(P＜0.01),MDA含量升高(P＜0.01);细胞PARK2 mRNA表达和Parkin蛋白表达降低(P＜0.01).相关性分析显示,PARK2 mRNA表达与细胞抑制率(线粒体损伤)、细胞内锰浓度及MDA含量呈负相关,r值分别为-0.872、-0.880、-0.862(均P＜0.01);PARK2 mRNA表达与SOD活性、DA含量以及Parkin蛋白表达呈正相关,r值分别为0.879、0.859、0.809(均P＜0.01).[结论]氯化锰暴露可引起SH-SY5Y细胞的线粒体损伤、氧化应激、DA分泌减少和PARK2表达下降.
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散发性早发帕金森病PARK2基因突变及其临床特征
目的 探讨42例散发性早发性帕金森病(EOPD)PARK2基因突变情况及突变患者的临床特点.方法 采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量以及DNA直接测序方法,对42例EOPD患者进行PARK2基因突变分析.结果 在42例EOPD患者中共发现5例PARK2基因突变,外显子杂合缺失突变、外显子纯合双重重复突变、复合杂合点突变各1例,另外2例存在相同的杂合小片段缺失突变.c.850G＞C和c.968-973delGTGTCC为已经报道的突变,c.925G＞T为未报道新突变.PARK2基因突变EOPD患者发病年龄比无PARK2基因突变者小.但是在统一帕金森病评定量表(UPDRS)3.0版第Ⅲ部分关期评分和Hoehr-Yahr关期评分上无差异.结论 散发性EOPDPARK2基因突变率为11.9％；点突变是散发性EOPD的主要突变类型；PARK2基因突变组和无突变组的EOPD患者在临床症状上和病情严重程度上无明显差异,但PARK2基因突变组发病年龄小,病程长,病情进展缓慢.
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锰对大鼠纹状体神经细胞PARK2表达的影响
目的 研究锰在RNA干扰条件下对大鼠纹状体神经细胞PARK2基因的影响.方法 使用不同浓度(0、100、300和500 μmol/L)的锰处理感染PARK2 shRNA的原代大鼠纹状体神经元细胞24 h,采用实时荧光定量和蛋白印迹法检测PARK2基因mRNA水平和蛋白质表达的变化.结果 在单纯感染慢病毒的纹状体神经细胞处理组中,不同锰处理浓度组与对照组比较,300和500 μmol/L锰浓度处理24 h后,PARK2mRNA及蛋白表达显著下降(P＜0.01).在感染慢病毒shRNA的纹状体神经细胞处理组中:不同锰处理浓度与对照组比较,PARK2 mRNA(P ＜0.01)及蛋白表达均显著下降(P＜0.05).结论 转染慢病毒载体PARK2shRNA的纹状体神经元细胞染锰24 h后进一步降低了PARK2 mRNA和蛋白的表达,该作用过程可能是锰致神经系统危害的作用机制之一.
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锰接触所引起全血中PARK2基因表达变化
目的 通过比较染锰大鼠和锰接触职业工人全血中PARK2基因表达的变化,探索锰所致神经系统危害的早期生物标志和可能的作用机制.方法 雄性SD大鼠24只随机分为对照组(n=8),低剂量组(n=8)和高剂量组(n=8).通过腹腔注射锰溶液(0、1、5mg/kg)每周5次,共4周.石墨炉原子吸收光谱法测全血中锰的含量；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法测PARK2基因的表达.结果 大鼠高剂量、低剂量与对照组比较,高剂量组PARK2基因表达明显下降；锰接触职业工人比非锰接触职业工人PARK2基因表达下降.结论 大鼠和职业工人的全血中PARK2基因的表达变化一致,全血中PARK2基因的表达变化可作为锰中毒的早期生物标志；PARK2基因异常导致UPP途径紊乱可能是锰引起神经中毒的一个作用机制.
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锰暴露早期生物标志探索
目的 通过研究锰暴露对血液和唾液中PARK2 mRNA表达的影响,探寻锰暴露的早期生物标志.方法 选择锰铁合金厂三年以上工龄的炉前工人作为锰接触组,以铁厂工人为对照组.原子吸收法测各组血液和唾液中锰浓度,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测各组血液和唾液中PARK2表达.结果 锰接触组工人血液和唾液中锰浓度均高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01)；与对照组相比,PARK2在血液和唾液中表达分别下降了54％和57％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 唾液口腔脱落细胞中PARK2基因的表达变化有作为锰暴露的早期生物标志的可能.
