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2,5-HD对大鼠DRG神经元神经丝蛋白表达的影响
目的 比较2,5-己二酮(2,5-HD)和3,3'-亚氨基二丙腈(3,3'-IDPN)对大鼠DRG神经元神经丝蛋白(NF-M)的损伤作用.方法 用出生后2 d的大鼠背根神经节(DRG)神经元,在培养皿中加不同浓度的2,5-HD和3,3'-IDPN进行培养,用荧光染料测定细胞毒性,计算细胞死亡率.用蛋白免疫荧光方法测定NF-M,计算DRG神经元细胞体的神经丝表达.结果 DRG神经元24 h接触2,5-HD和3,3'-IDPN的LD50约为32和102 mmol/L.DRG细胞体内的NF-M蛋白含量在接触2,5-HD(0、4、8和16 mmo/L浓度)24和48 h后结果显示,各个剂量组均有明显降低(P＜0.05.P＜0.01);而在接触3,3'-IDPN 24 h后,各个剂量组之间没有发生明显改变,但在接触48 h后,仅有64,128 mmol/L组与对照相比,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).在DRG神经元具有相同死亡率时,2,5-HD和3,3'-IDPN 24 h后对NF-M蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 2,5-HD与3,3'-IDPN对NF-M的损伤不同.2,5-HD减少NF-M蛋白表达要早于细胞死亡.NF-M对2,5-HD比对3,3'-IDPN敏感.
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一种适合膜片钳单通道记录的大鼠DRG神经元急性分离方法
目的:建立一种适合膜片钳单通道记录的脊髓背根神经节神经元急性分离方法.方法:用酶消化和机械分离相结合的方法急性分离大鼠DRG神经元.结果:用本方法分离的DRG细胞容易形成较高的封接电阻(＞5GΩ),降低了噪音干扰,可记录到pA级的单通道电流.结论:本方法急性分离的DRG神经元适合单通道膜片钳实验研究.
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推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X3受体影响的实验研究
目的:观察推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X3受体的影响,探讨推拿对腰椎间盘突出症镇痛效应的外周机制.方法:32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、假手术组、推拿组.空白组不做任何处理,模型组和推拿组均将“L”形不锈钢柱插入椎间孔对DRG造成恒定压迫,假手术组除不将“L”形不锈钢柱插入椎间孔外,其余造模步骤同模型组.推拿组在造模后第4天开始推拿手法治疗,其余组均不做治疗.疗程结束后,检测大鼠机械反应阈值(PWT)、缩爪反应潜伏期(PWL),采用Western Blot方法观察DRG神经元P2X3受体含量的变化.结果:空白组、假手术组大鼠在造模后PWT、PWL均没有显著性差异(P＞0.05),模型组大鼠造模后PWT、PWL均显著降低(P ＜0.001),推拿治疗后与模型组相比较具有显著性差异(P＜0.05).与空白组、假手术组相比,模型组大鼠DRG神经元P2X3受体含量明显升高(P＜0.001),推拿治疗后P2X3受体含量较模型组降低(P＜0.05).结论:推拿对腰椎间盘突出症大鼠有镇痛作用;推拿能够降低腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X3受体的水平进而发挥镇痛效应.
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小直径DRG神经元上表达的电压门控离子通道特性
目的 建立一种简单易行,满足多种药理学实验需要的大鼠DRG神经元急性分离方法,探讨大鼠DRG神经元的电生理特性.方法 对160～ 220 g SD大鼠DRG神经元进行急性分离,并采用全细胞膜片钳技术记录电压门控离子通道钠电流、钙电流和钾电流.结果 急性分离的大鼠DRG神经元呈圆形或椭圆形,胞质均一,折光性好,所表达的钠通道电流、钙电流和钾电流符合其电生理特性.结论 运用该方法急性分离细胞操作简单易行,容易获得和辨认,电生理特征明确,适用于疼痛等疾病的电生理研究和相关药物的作用机制考察.
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甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元激活内向电流的抑制
本研究探讨了甲硫-脑啡肽(met-Enk)对ATP-激活电流(IATP)的调制作用.实验在大鼠新鲜分离背根神经节(DRG)神经元上进行.应用全细胞膜片钳技术所记录的IATP为内向电流.在被检测的DRG神经元中,90.0%(45/50)的细胞对ATP有反应.在45个对ATP敏感的细胞中:对大部分细胞(29/45)施加met-Enk(10-9～10-5mol/L)也引起一内向电流;少部分细胞(9/45)为外向电流;其余的细胞(7/45)未引起可检测的膜反应.预加met-Enk后IATP明显地被抑制,此种抑制作用为剂量依赖性的.在预加10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L met-Enk后,IATP的抑制分别为:13.2±5.4%(n=5)、39.2±8.6%(n=8)、54.1±8.6%(n=8)、43.3±7.9%(n=7);43.1±7.9%(n=7)(mean± SKM).阿片肽拮抗剂纳洛酮能翻转此种抑制效应.IATP的量-效关系表明,预加met-Enk后曲线明显压低,在浓度为10-3 mol/L时IATP下降约25%,而Kd值几乎不变.应用二次钳压技术胞内透析H-9(PKA抑制剂)能取消此种抑制作用.上述结果提示:met-Enk对IATP的抑制效应为非竞争性抑制作用,可能是由于阿片受体激活后,经相应的胞内信号转导途径使ATP受体磷酸化所致.
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壳寡糖促神经元生长的作用
目的 研究壳寡糖(COSs)对大鼠神经元生长的影响.方法 以体外培养的背根神经节(DRG)和DRG神经元为研究模型,通过神经丝蛋白-H(NF-H)免疫荧光细胞化学染色和Leica QWin软件检测不同浓度壳寡糖(0.0、0.1、0.2 mg/ml)作用5d对DRG和DRG神经元突起生长的影响；通过Western blot检测不同浓度壳寡糖(0.05、0.1、0.2 mg/ml)作用DRG神经元12h后,对DRG神经元中NF-H和生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的影响.结果 与对照组相比,中、高剂量壳寡糖(0.1、0.2 mg/ml)显著促进DRG突起的生长(均P＜0.01)；0.2 mg/ml剂量的壳寡糖明显促进DRG神经元突起的生长(P＜0.05).与对照组相比,体外培养的DRG神经元加入壳寡糖作用12 h后,0.2 mg/ml剂量壳寡糖组的NF-H和GAP-43表达量明显增加(分别P＜0.05和＜0.01).结论 壳寡糖可有促进体外培养的DRG和DRG神经元突起的生长,并可促进NF-H、GAP-43的表达.
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多巴胺增强培养新生大鼠DRG神经元ATP激活电流
目的：探讨多巴胺对ATP激活电流的调制作用。方法：实验在培养的新生大鼠脊髓背根神经节细胞上进行，应用全细胞膜片钳技术记录出ATP和多巴胺激活的电流。结果：在被检的DRG细胞中，有62%(39/63)的神经元对ATP和多巴胺都敏感。在预加10-8,10-7,10-6和10-5 mol/L多巴胺后，ATP的激活电流分别增加到139.7%,141.5%,149.9%,149.1%；呈剂量依赖性。用D1的拮抗剂SCH-23390能取消此增强作用；在电极中灌注H-7(PKC,PKA抑制剂)也能取消此增强作用。结论：多巴胺对ATP激活电流的增强作用是多巴胺作用于D1受体，通过胞内第二信使，使P2X受体通道复合体胞内磷酸化所致。
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一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法
目的 建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法.方法 采用结合酶消化及机械分离的方法,急性分离成年大鼠DRG神经元,用于膜片钳研究.结果 本方法可分离2～3个月的成年大鼠,不损伤神经元的基本结构和电生理学特性,形态上易于区分.结论 本方法步骤单一,操作简单,分离效率高,适合膜片钳研究.
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大鼠慢性背根节压迫诱致DRG大神经元兴奋性增强和Ih电流显著上调
目的:探讨大鼠CCD模型模拟的腰背痛诱致的DRG大神经元兴奋性改变及其离子通道机制.方法:建立大鼠慢性压迫腰膨大L4/L5 DRG的CCD模型,模拟临床常见的腰背痛的触诱发痛表现.制备整节L4/L5 DRG标本,应用全细胞膜片钳技术记录去极化电流刺激诱致的DRG大型神经元的兴奋性改变及其离子通道机制.结果:对直径＞ 50 μm的健康的DRG大神经元进行全细胞膜片钳记录.结果显示:给予去极化方波电流刺激可以诱致CCD模型大鼠DRG大神经元呈现兴奋性增强的表现,具体表现为相同刺激强度的电流注射在CCD模型DRG大神经元上诱致的动作电位的频率显著高于对照组神经元.同样的细胞放电增强也见于给予细胞斜波电流刺激.进一步的机制研究分析显示CCD模型大鼠上DRG大神经元的Ih电流明显高于对照组大鼠.结论:CCD模型可以诱致DRG大神经元呈现超兴奋状态,该兴奋性增强的状态主要由Ih电流增强来介导,为认识神经损伤诱致的病理性痛觉敏化尤其是触诱发痛的神经机制提供了实验证据.
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基于雪旺细胞-背根节神经元共培养建立周围神经髓鞘化体外模型
目的:为探讨雪旺细胞与背根节(DRG)神经元髓鞘化共培养的标准化方法,并建立周围神经髓鞘化体外模型.方法:采用新生大鼠DRG神经节组织块培养法和胚胎大鼠DRG神经节分散培养法分别进行雪旺细胞和DRG神经元的培养和纯化,将雪旺细胞接种到培养DRG神经元的盖玻片上,按髓鞘化共培养程序进行雪旺细胞-DRG神经元共培养.结果:(1)雪旺细胞和DRG神经元的纯度、数量及比例;(2)共培养载体的包被基质;(3)髓鞘化共培养步骤和培养基成分是影响髓鞘形成的关键因素.原代雪旺细胞和DRG神经元S-100、神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色结果显示其纯度分别达到95%、90%;在髓鞘化培养基中共培养14 d后相差显微镜和扫描电子显微镜下均观察到雪旺细胞包裹DRG神经元轴突形成髓鞘节段,髓鞘碱性蛋白免疫荧光染色结果显示免疫反应性;共培养体系和髓鞘结构可保持两个半月左右.结论:基于雪旺细胞和DRG神经元的条件化共培养能建立一种可靠的周围神经髓鞘化体外模型,为周围神经髓鞘化的主要调节因素及其作用机制研究提供有效的实验模型.
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福尔马林致痛上调大鼠DRG神经元SP与NMDA受体的表达
目的:观察DRG 神经元膜SP 受体与NMDA 受体的表达,探讨二者在疼痛中的作用.方法:16只健康SD大鼠随机分为生理盐水(NS)组及福尔马林致痛(F)组,应用免疫荧光双标技术观察并比较两组大鼠DRG 神经元膜SP 受体与NMDA 受体的表达的差异.结果:免疫荧光显示两组大鼠DRG 神经元膜均有SP受体与NMDA 受体共存.F组大鼠DRG神经元膜SP(NK1)的表达高于NS组,OD 值分别为99.37±19.69(n=8)、60.10±21.65(n=8),P＜0.05;F 组大鼠DRG神经元膜NMDA(NR1)阳性产物的表达高于NS组,OD 值分别为89.17±30.05(n=8)、56.31±13.75(n=8),P＜0.05.结论:大鼠DRG神经元膜SP 受体与NMDA 受体有共存,福尔马林致痛大鼠DRG 神经元SP 受体与NMDA 受体表达上调.
