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活细胞成像技术研究2,5-己二酮对中分子量神经丝运输的影响
目的 用活细胞成像技术研究2,5-己二酮对中分子量神经丝蛋白(NF-M)在体外培养的背根神经节神经元轴突中的运输的影响.方法 转染pPA-GFP-NFM质粒的背根神经节神经元体外培养,给予2,5-己二酮作用24 h后,荧光显微镜下定量观察GFP-NFM的转运量.结果 给药4、8和16 mmol/L 2,5-HD组,NF-M在轴突中被转运的量分别为28.5±11.6％(P＜0.05)、22.6±9.2％(P＜0.01)和18.5 ±8.6％(P＜0.01),而空白对照组中NF-M被转运的量为35.6±11.0％.结论 2,5-己二酮降低了NF-M的轴浆运输速率,这可能是2,5-己二酮引起中毒性周围神经病的致病机制之一.
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破骨细胞血系起源的活细胞成像观察
目的:采用活细胞成像技术,观察血系单核细胞诱导形成破骨细胞的全过程,旨在进一步阐明破骨细胞血系起源的发生及其细胞动力学.方法:取成年SPF级纯种雄性SD大鼠1只,体重280 g,腹主动脉采血8ml,经密度梯度离心分离单个核细胞,在RANKL与M-CSF诱导下,分为例置相差显微镜观察组、抗酒石酸酸性磷酸酶染色组、噬骨试验扫描电镜观察组、活细胞成像组4组进行培养.倒置相差显微镜观察组从培养开始,在数字显微成像系统下,每天观察记录1次；抗酒石酸酸性磷酸酶染色组培养21 d作酶活性染色鉴定；噬骨试验扫描电镜观察组培养21d取出骨磨片作扫描电镜观察；活细胞成像组采用多点位缩时电影法对整个培养过程进行长达35 d的连续观察记录.结果:诱导培养2周后,倒置相差显微镜观察可见大量多核细胞形成,外形呈圆形、梭形、扇形、椭圆形及不规则突起状；抗酒石酸酸性磷酸酶染色绝大部分多棱细胞与单核细胞均呈阳性反应；骨磨片扫描电镜观察可见较多骨吸收陷窝、坑洼及沟道,还有位于陷窝及沟道内正在行使骨吸收功能的破骨细胞；活细胞成像观察到起源于周围血的多核破骨细胞是由单核细胞、单核细胞与多核细胞及多核细胞之间相互融合而成,其细胞间的融合均发生在贴壁状态,显微缩时电影观察显示破骨细胞形态表现复杂多变.结论:大鼠周围血单核细胞在RANKL和M-CSF诱导下,可以向破骨细胞分化,形成具有骨吸收功能的多棱破骨细胞.破骨细胞的形成是发生在贴壁状态下多种形式的细胞融合过程,破骨细胞的粘附特性对其存活及功能发挥至关重要.破骨细胞具有吞噬功能,其形态结构动态多变.破骨细胞不仅是一种多核细胞,还可能包括单核破骨细胞.破骨细胞通过融合形成多棱巨细胞的特性,可能是其适应功能需求与骨吸收效率的一种特殊生物学行为.实验结果进一步证实了破骨细胞的血系起源学说,并为深入阐明破骨细胞的细胞动力学与细胞生物学特性提供了新的实验研究依据.
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新生大鼠培养海马神经元的双重转染和活细胞成像
目的：建立新生大鼠海马神经元的双重转染和活细胞成像方法。方法出生24 h内的SD大鼠海马神经元原代培养，接种后第5天双重转染表达绿色荧光蛋白的GFP-GluR1和红色荧光的DsRed，活细胞成像观察转染后细胞情况。结果转染48 h后神经元基本稳定，发绿色荧光，胞体大呈多边，立体感强，突起长且连接密集；可以在不同时间点定位观察同一部位；双重转染GluR1-GFP和DsRed质粒48 h后，可在倒置显微镜下观察到荧光，GluR1-GFP表达于树突，DsRed表达于树突棘。结论获得了稳定可行的神经元双重转染技术和长时程在不同时间点定位追踪观察培养神经元的成像方法。
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破骨细胞微管正端蛋白动态成像观察
目的：采用活细胞成像技术观察破骨细胞微管正端蛋白EB1在细胞内的分布及运动，初步研究微管在破骨细胞功能中的作用。方法①用脂质体转染方法（阳离子脂质体Lip2000）转染EB1?GFP基因至Raw264?7细胞系，G418筛选转染成功的Raw264?7细胞，荧光显微镜下观察后GFP蛋白免疫荧光染色确定稳定转染EB1?GFP的Raw264?7细胞系建立；②活细胞工作站下观察转染EB1?GFP的Raw264?7细胞中EB1蛋白的运动；③用含100ng／mLRANKL和30ng／mL M?CSF的培养基分别诱导稳定转染EB1?GFP的Raw264?7细胞与正常Raw264?7细胞为破骨细胞，进行TRAP染色鉴定，比较两组细胞形态有无差别；④Raw264?7细胞系诱导出破骨细胞后，用细胞免疫荧光染色方法观察破骨细胞EB1蛋白的形态及分布；⑤活细胞工作站下观察稳转EB1?GFP的Raw264?7细胞诱导出的破骨细胞内EB1蛋白的运动状态。结果①脂质体转染方法建立了稳定转染EB1?GFP基因的Raw264?7细胞系；②观察到破骨前体细胞Raw264?7的微管正端蛋白（ EB1）的运动轨迹；③转染EB1?GFP基因的Raw264?7细胞与正常Raw264?7细胞诱导的破骨细胞TRAP染色无明显差别；④活细胞工作站观察破骨细胞微管正端蛋白EB1的运动状态，结果表明破骨细胞微管活动性较破骨前体细胞Raw264?7活动性低。结论①EB1?GFP基因对破骨前体细胞系Raw264?7诱导破骨细胞无明显影响；②微管活动性降低可能与破骨细胞骨吸收活性相关。
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双光子显微成像技术的新进展
双光子显微成像技术是近年发展起来的一种新型非线性光学成像方法,由于其优异的特性已广泛用于细胞生物活细胞、组织的长时间动态三维成像.文中首先介绍了双光子成像的原理和特点;在此基础上总结了双光子显微成像技术的研究热点,其次并分别就如何获得更低的细胞损害,更快的图像获取速度和更高的成像灵敏度三个方面作了论述;后展望了双光子显微成像技术的发展前景.
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活细胞成像技术实时追踪荧光蛋白标记的分枝杆菌的胞内增殖
目的 利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记和活细胞显微成像的方法,实时追踪分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖过程.方法 用经GFP标记的野生型海分枝杆菌(Mycobacterium marinum,Mm)分别侵染未激活和γ-干扰素激活的巨噬细胞,使用活细胞显微成像系统连续记录胞内分枝杆菌的增殖动态,同时优化不同细胞接种浓度和感染复数(multiplicity of infection,MOI)对胞内菌增殖动态的追踪效果.结果 使用GFP标记和活细胞成像的方法可以实时追踪胞内分枝杆菌的增殖过程和形态学变化.γ-干扰素对Mm在巨噬细胞中的增殖有抑制作用.当接种巨噬细胞浓度为1×105/孔,MOI为1时,可直观清晰地分析实时追踪图像中胞内菌的增殖过程.结论 通过活细胞成像技术分析荧光蛋白标记的分枝杆菌,可实时追踪巨噬细胞内分枝杆菌增殖过程和形态学变化,是一种体外分析胞内分枝杆菌增殖的理想方法,可应用于其他相关病原菌和宿主相互作用及影响因素的研究.
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细胞大型内吞囊泡快速标记方法的改进和应用
为了研究细胞内大型内吞囊泡的快速动态变化,本文借鉴了诱导神经元轴突诱导转向的方法,通过脉冲压力从微电极释放诱导因子,在细胞周围形成稳定的浓度梯度,诱导细胞产生胞饮泡,并通过局部染料释放进行快速标记和洗脱.同时利用活细胞成像技术,对胞饮泡标记过程以及标记后胞饮泡动态变化进行实时记录.该方法大大缩短了标记和洗脱的时间,从而实现了对细胞囊泡的快速标记和同步观察记录,可用于胞饮泡、溶酶体等细胞囊泡的动态标记和观察,是研究细胞大型内吞囊泡动态变化的一种实用且高效的手段.
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证明细胞纠缠
科学技术的发展提供了证明细胞纠缠的可能.干细胞可能是纠缠细胞的来源,单细胞分析(single-cell sequencing,SCS)和活细胞成像(live cell imaging)可观察到细胞基因组和细胞行为的微妙变化,寻找细胞纠缠的证据.共同刺激可能是细胞纠缠的基础.
