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新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测
背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道.目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用.方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒Sall和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×10~8pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P＞0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达.结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体.
关键词： 骨形态发生蛋白2基因 反转录病毒 成骨细胞 四甲基偶氮唑盐 蛋白表达 -
新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定
目的 构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体.方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点Xho Ⅰ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1.携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌,利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒.用Pac Ⅰ酶切去除其质粒成分,暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列,转染293细胞,进行腺病毒的包装,完成新型腺病毒载体Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建.作为阳性对照,同时制备多年来广为应用的BMP2腺病毒表达载体Ad CMV-BMP2.以两种载体感染骨髓基质细胞,通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用.结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计.感染骨髓基质细胞后,新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2.结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体.
关键词： 骨形态发生蛋白2基因 绿色荧光蛋白 腺病毒载体 同源重组 成骨诱导 -
地塞米松诱导促进BMP-2基因转染的兔MSCs的成骨转化
目的: 研究地塞米松诱导对BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.方法: 将地塞米松诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-2基因后,以RT-PCR和免疫组化方法检测转导后细胞BMP-2的表达;通过观察细胞生长及碱性磷酸酶活性和骨钙素含量的测定,分析地塞米松诱导对BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.结果: 转导后BMP-2基因在两组rMSCs中均有表达,定量分析显示诱导组细胞碱性磷酸酶活性(134.36±8.84) nkat/L较对照组(104.02±7.83) nkat/L明显增高;诱导组细胞骨钙素含量(14.68±0.73) μg/L较对照组(6.52±1.21) μg/L明显增高.结论: 转导前地塞米松诱导能够促进BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和成骨转化.
关键词： 骨髓细胞 干细胞 骨形态发生蛋白2基因 地塞米松 成骨转化
