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骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜
背景:用骨膜修复骨缺损,已被大量实验所证实.但其来源有限,限制了临床大量应用.因此,应用组织工程学的原理和方法构建人工骨膜,值得进一步探索和研究.目的:将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜.方法:取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增培养、成骨诱导分化及鉴定.将诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜.观察细胞在生物材料上附着、生长、增殖及细胞分泌细胞外基质情况.结果与结论:经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层上黏附、增殖速度加快,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分,骨膜厚度随复合培养时间的延长而增加,类似生物骨膜.说明将经成骨诱导的骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合可以构建具有生理功能的组织工程骨膜.
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不同预湿方法对构建组织工程骨膜细胞黏附率的影响
目的:将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合,构建的组织工程骨膜,与天然骨膜在形态结构和功能上非常类似.实验着重观察不同预湿方法对构建的组织工程骨膜细胞黏附率的影响,为有效构建组织工程化骨膜奠定理论基础.方法:实验于2005-09/2007-03在兰州大学附属第二医院骨科研究所完成.①实验材料:20 d的新西兰纯种兔2只.②实验过程及分组:取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化,然后与经过胎牛血清(实验组)、磷酸盐缓冲液(对照组)预湿处理的猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜,体外培养2周.③实验评估:计算贴附率、测定碱性磷酸酶活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察生长、分裂、增殖情况.结果:①细胞贴附率:接种后5h实验组细胞贴附率高于对照组[(57.34±2.23)%,(39.16±5.22)%,P＜0.01];12 h实验组细胞贴附率高于对照组[(72.45±1.15)%,(54.47±3.46)%,P＜0.01].②倒置显微镜观察:实验组比对照组更易黏附、伸展.③扫描电镜观察:复合培养第3天,实验组可见材料表面的细胞已完全伸展,附着在材料表面;对照组细胞大多呈不规则形,未完全伸展.培养7 d以后两组细胞差异不大.④碱性磷酸酶活性测定:复合培养第5,10,14天,实验组的碱性磷酸酶活性均明显高于对照组,差异有非常显著性(P＜0.01).结论:用胎牛血清预湿小肠黏膜下层,有利于提高接种效率,从而能更有效的构建组织工程骨膜.
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组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损
背景：研究证明骨膜在骨缺损的修复方面起着重要作用，然而大段骨缺损常常伴随骨膜的缺失。因此运用组织工程学原理构建组织工程骨膜修复骨缺损已成为研究热点。目的：通过外周血来源间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建组织工程骨膜，观察其包被双相陶瓷磷酸钙支架对兔骨缺损的修复。方法：将外周血间充质干细胞接种于SIS膜(猪小肠黏膜下层)上构建组织工程骨膜，并通过活死细胞染色观察间充质干细胞生长情况。取30只新西兰兔构建15 mm尺骨缺损模型，随机等分为空白对照组、单纯磷酸钙陶瓷组、组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组分别进行相应的骨缺损修复处理。通过术后标本影像学、组织学观察对比3组骨缺损修复情况。结果与结论：①外周血间充质干细胞接种于SIS膜后细胞活死染色发现间充质干细胞生长良好，数量逐渐增多；②X射线片Lane-Sandhu评分：体内实验中，术后4，8周组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组X射线片Lane-Sandhu评分显著高于单纯磷酸钙陶瓷组(P<0.05)，单纯磷酸钙陶瓷组高于空白对照组(P<0.05)；③组织学变化：术后4，8周组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组骨基质形成多于单纯磷酸钙陶瓷组，基质周围有较多成骨细胞分布；④结果显示，外周血间充质干细胞和SIS膜构建的组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙对骨缺损有良好的修复作用。
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体外构建人工仿生骨膜
背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性，又富含多种生长因子，能明显促进细胞的黏附、增殖及分化，在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复，且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。
目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜，观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。
结果与结论：接种5 d后，细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上，细胞形态呈圆形，细胞之间无连接；10 d后细胞之间形成桥粒连接，成骨细胞伸出突起，与小肠黏膜下层贴附；15 d后细胞增殖，分泌基质，在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜，有可能成为理想的组织工程支架材料。 -
组织工程骨膜技术及其在治疗骨缺损中的应用
目前,外伤、感染、肿瘤等疾病所导致的骨缺损的治疗仍是临床上急需解决的问题.传统自体骨移植是治疗局部骨缺损的金标准,但存在供骨区并发症及数量有限等缺点.而异体骨移植则存在排异和传染疾病等缺点.因此研究者利用组织工程技术,从结构和功能上模拟天然骨膜,从而修复骨缺损.本文对组织工程骨膜技术及其在治疗骨缺损中的应用进展进行综述.
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组织工程骨膜同种异体体内修复兔肩胛骨大段骨缺损的实验研究
[目的]对比观察组织工程骨膜(tissue-engineered periosteum,TEP)及脱蛋白骨对兔肩胛骨大段骨缺损的修复效果,探讨组织工程骨膜通过膜内化骨修复大段不规则骨缺损的可行性.[方法]将体外分离培养的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)传代扩增及成骨诱导后,与自制的猪小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)复合培养构建组织工程化骨膜.选取2个月龄新西兰大白兔60只,行肩胛骨次全切除术,制作大段不规则骨缺损模型.随机分为5组,每组12只:A组在骨缺损区置入TEP;B组在骨缺损区置入脱蛋白骨(deproteinization bone,DPB);C组在骨缺损区置入TEP+ DPB复合体;D组、E组则分别为造模后不处理空白组和切除骨保留自身骨膜组.术后4、8、12周时,各组每次分别处死4只动物收集标本,进行X线片及组织学检测,对比分析各组肩胛骨大段骨缺损的修复效果.[结果]X线表现:不同时间段,A、C组均有相当数量的新生骨形成,密度接近正常骨.其中C组外观形态与正常肩胛骨相似,塑形好,与E组密度较接近.B组DPB逐渐被吸收,无骨缺损修复征象.D组缺损区始终无高密度影出现.组织学表现:A、C、E组4周时以多点方式形成新骨,8周时出现岛状生长的骨组织,12周时新生骨趋成熟,呈编织状排列,可见血管腔.B、D组仅为胶原瘢痕组织,无新骨生成.[结论]组织工程骨膜可修复兔肩胛骨大段骨缺损,其通过膜内化骨修复大段不规则骨缺损是可行的.
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组织工程骨膜及脱蛋白骨修复兔桡骨大段骨缺损的早期观察
[目的]比较组织工程骨膜及脱蛋白骨对兔桡骨大段骨缺损的早期修复效果,研究组织工程骨膜移植修复大段骨缺损的可行性.[方法]分离兔骨髓间充质干细胞体外诱导增殖,制成细胞悬液接种于猪小肠黏膜下层表面,构建组织工程骨膜.3个月龄新西兰大白兔24只,随机分为3组各8只,手术制备单侧桡骨干30 mm骨膜-骨缺损模型,A组缺损区植入组织工程骨膜骨修复,B、C组则分别以猪小肠黏膜下层和脱蛋白骨作为对比.术后4周,行X线检查并杀取标本予以组织学染色及评分.[结果]经放射学和组织学观察,在A组中缺损区可见大量新骨形成并桥连两缺损端;而在B组和C组中无明显新骨产生.[结论]使用组织工程骨膜修复同种异体兔桡骨大段骨缺损是可行的,且明显优于脱蛋白骨.
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组织工程化骨膜的构建及其在体外的成骨活性检测
[目的]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程骨膜,体外观察其生物学特性并检测成骨活性,为将来体内移植提供实验依据.[方法]以猪小肠粘膜下层基质作为支架材料,与新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)或体外成骨诱导培养后的BMSCs,采用沉淀法复合构建两种组织工程化骨膜(M2及M1),用MTT法检测种子细胞在支架材料上的生长情况;扫描电镜(SEM)观察种子细胞在支架材料上的生长、粘附状态;通过ELISA检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌水平.[结果]种子细胞在SIS上生长良好,M2及M1在含有成骨诱导剂的培养基中培养可分泌一定量骨钙素(11d达峰值),并表达碱性磷酸酶活性(7d达峰值).而且,Ml所分泌骨钙素的量与碱性磷酸酶活性高于M2,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程化骨膜能够保持较稳定的生物活性,种子细胞能良好地在支架上附着、生长增殖,并稳定地分泌一定量的骨钙素和碱性磷酸酶,在体外表达较强的成骨活性.
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组织工程骨膜及脱蛋白骨辅助支架修复兔桡骨大段骨缺损
目的 评价组织工程骨膜体内成骨修复兔大段骨缺损及同种异体脱蛋白骨(deproteinized bone,DPB)作为组织工程骨膜辅助支架材料的效果.方法 分离培养1月龄新西兰大白兔BMSCs,以成骨诱导培养液诱导成骨分化后,与猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合构建组织工程骨膜,扫描电镜观察细胞与SIS复合情况.取新鲜同种异体骨段细密打孔后进行脱蛋白处理,制成DPB支架材料.将组织工程骨膜呈“外套状”包被DPB,并用可吸收缝线捆扎制备组织工程骨膜/DPB复合体.取4月龄清洁级新西兰大白兔48只,随机分成A、B、C、D4组(n=12),切除左侧桡骨干3.5 cm长骨段制作大段骨缺损动物模型.A、B、C组分别于骨缺损处植入组织工程骨膜、DPB和组织工程骨膜/DPB复合体,D组骨缺损旷置.术后4、8、12周各组随机取4只动物行X线片观察及评分;术后8周各组随机处死4只动物,取骨缺损区标本行HE及Masson染色观察.结果 扫描电镜观察构建的组织工程骨膜示SIS上黏附大量细胞.X线片检查示术后各时间点A、C组新生骨组织量明显多于B、D组.术后各时间点A、C组X线片评分显著高于B、D组,A组高于C组,B组高于D组,差异均有统计学意义(P＜ 0.05).组织学观察示A组骨缺损处为大量新生骨组织,新生骨组织中可见不规则髓腔样结构及丰富的血管腔;B组骨缺损处见植入的DPB,DPB降解不明显;C组骨缺损处见较多新生骨组织,新生骨组织中可见呈岛状分布的DPB,DPB降解明显;D组骨缺损处仅见少量胶原纤维.结论 以SIS和BMSCs构建的组织工程骨膜可修复兔桡骨大段骨缺损;DPB不能对组织工程骨膜成骨起到理想的支架作用,组织工程骨膜辅助支架材料有待进一步探索.
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组织工程骨膜同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损的初步研究
目的 以兔BMSCs和猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合构建组织工程骨膜,植入同种异体兔体内修复肩胛骨缺损,探讨组织工程骨膜修复大块不规则骨缺损的可行性. 方法 取2周～1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,取猪近端空肠制备SIS,两者复合构建组织工程骨膜.取6月龄新西兰大白兔18只制备单侧肩胛骨3 cm × 3 cm次全切骨缺损模型,随机分为实验组和对照组(n=9),分别于缺损处植入组织工程骨膜和单纯SIS.术后观察动物大体情况;8周时处死动物后行X线片观察并按Lane-Sandhu X线片评分标准评分;标本大体观察后,行HE及Masson染色观察. 结果 实验动物术后进食、活动均正常,切口无红肿、渗液.X线片观察示实验组骨缺损区有片状新生骨形成,密度与正常骨相同;对照组骨缺损区无骨形成征象,骨缺损区密度与周围软组织影相似.X线片评分实验组为(6.67±0.32)分,对照组为(0.32±0.04)分,比较差异有统计学意义(t=19.871,P=0.001).标本大体观察示实验组两端桥接部已形成骨性愈合,部分骨缺损区被新生骨填充;对照组无骨组织生成.HE及Masson染色示实验组骨缺损处有新骨生成,骨组织中可见血管腔及髓腔样结构,未见明显巨噬细胞及淋巴细胞浸润;对照组骨缺损区仅为胶原瘢痕组织和纤维样结构,无骨组织生成. 结论 以兔BMSCs和猪SIS构建的组织工程骨膜在同种异体兔体内可以成骨,具有修复大块不规则骨缺损的可行性.
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组织工程骨膜异体体内成骨修复兔骨缺损的初步观察
目的 探讨以兔BMSCs和猪SIS复合构建的组织工程骨膜,在异体兔体内成骨的可行性. 方法 取新西兰大白兔BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜.选2月龄新西兰大白兔12只,制备双侧桡骨1.5～2.0 cm缺损模型.随机选一侧植入组织工程骨膜,作为实验组;另一侧仅植入单纯SIS,作为对照组.术后观察动物一般情况,4周后摄X线片观察,取骨缺损中段标本行HE及Masson染色观察. 结果 两组动物术后饮食及日常活动基本正常;伤口无红肿、溢脓等;伤肢基本能负重行走.X线片观察:实验组骨缺损处有长条状新生骨形成,密度与正常骨相同,新生骨桥接骨缺损;对照组骨缺损无骨形成征象,骨缺损处密度与周围软组织影相近.组织学观察:实验组骨缺损处有新骨形成,骨组织中可见血管腔及不规则髓腔样结构;未见明显异物巨噬细胞及淋巴细胞浸润征象;对照组骨缺损处仅为胶原瘢痕组织,无骨组织形成. 结论 以SIS和BMSCs构建的组织工程骨膜在同种异体体内可以成骨,有修复骨缺损的可行性.
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成骨细胞Cbfa1和Osterix基因在体外构建组织工程骨膜中的表达
目的体外构建组织工程骨膜,研究生物衍生羊膜(human acellular amniotic membrane, HAAM)对成骨细胞分化的影响. 方法采用人胚骨膜来源的成骨细胞与HAAM体外复合培养构建组织工程骨膜(n=60).于培养后2、4、6、8和10 d,分别提取总RNA,经过逆转录成cDNA,行实时定量PCR,分别扩增成骨细胞特异转录因子(Cbfa1)和成骨细胞特异基因(Osterix),读取扩增循环数(cycle threshold,Ct).以单纯培养的成骨细胞作为对照组(n=20). 结果实验组Cbfa1表达以培养后2 d和10 d高,且培养后2 d与4、6、8 d比较,以及培养后10 d与4、8 d比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组Osterix表达随培养时间延长逐渐升高,培养后8 d达高,与其余各时间点比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组Cbfa1和Osterix表达均随培养时间延长逐渐降低.组间各时间点两基因表达差异均无统计学意义(P>0.05). 结论成骨细胞与HAAM结合后,Cbfa1和Osterix可持续正常表达.HAAM作为支架材料,可诱导并促进成骨细胞分化.成骨细胞与HAAM构建的组织工程骨膜在分子水平已具有产生骨组织的基础.
