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人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架的生物相容性
背景:前交叉韧带损伤越来越多见,传统治疗方式主要是前交叉韧带重建,随着组织工程研究在临床广泛运用,韧带组织工程治疗前交叉韧带损伤已成为目前研究的热点.目的:探讨人羊膜间充质干细胞和人脱细胞羊膜支架的体外生物相容性.方法:采用酶消化法获得人羊膜间充质干细胞并对其进行鉴定.采用酶消化法和化学去污法对新鲜人羊膜进行脱细胞处理,以苏木精-伊红染色以及免疫荧光染色检测细胞成分移除情况以及细胞外基质破坏情况.取第3代人羊膜间充质干细胞,分别使用人脱细胞羊膜浸提液(实验组)与普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养, CCK-8法检测两组细胞增殖能力.人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养14 d后,扫描电镜与倒置显微镜观察人脱细胞羊膜上的细胞黏附及生长情况.结果与结论:①倒置相差显微镜观察显示人羊膜间充质干细胞呈漩涡状、贴壁生长,高表达波形蛋白,低表达CK-19,具有成骨、成脂、成软骨诱导分化能力;②苏木精-伊红染色显示人脱细胞羊膜上皮细胞及间充质干细胞已完全移除,细胞外基质成分无明显破坏;免疫荧光染色显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原均呈阳性表达;③人脱细胞羊膜浸提液对人羊膜间充质干细胞无细胞毒性,不影响其增殖活性;④倒置相差显微镜及扫描电镜均显示人脱细胞羊膜可以促进人羊膜间充质干细胞增殖及黏附,二者具有良好的生物相容性.
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组织工程骨膜技术及其在治疗骨缺损中的应用
目前,外伤、感染、肿瘤等疾病所导致的骨缺损的治疗仍是临床上急需解决的问题.传统自体骨移植是治疗局部骨缺损的金标准,但存在供骨区并发症及数量有限等缺点.而异体骨移植则存在排异和传染疾病等缺点.因此研究者利用组织工程技术,从结构和功能上模拟天然骨膜,从而修复骨缺损.本文对组织工程骨膜技术及其在治疗骨缺损中的应用进展进行综述.
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脱细胞羊膜负载骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的实验研究
目的 研究人脱细胞羊膜(HAAM)负载骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复兔膝关节软骨缺损的效果.方法 分离、培养兔BMSCs,以1.63×105/cm2的密度接种于HAAM上,培养6～9d后行细胞与羊膜复合体的电镜及光镜检查.实验兔24只,随机分为A、B两组,每组12只,建立兔膝关节髁间窝非负重区关节软骨缺损模型,右膝为空白对照侧,不植入任何材料,左膝为实验侧.A组左膝植入BMSCs与HAAM复合体(复合组),B组左膝植入单纯HAAM(HAAM组).术后8、12周,对缺损部位行大体观察、组织学观察及Wakitani的评分,评估新生组织修复软骨缺损的效果. 结果 大体观察结果表明,A组术后8、12周实验侧出现类软骨组织,而对照侧由纤维样组织填充；B组术后8、12周无类软骨组织出现,对照侧新生组织质地较硬.组织学观察结果表明,A组术后8、12周实验侧均类软骨细胞密集,而12周类软骨细胞数较多,并出现类软骨基质,对照侧无类软骨细胞形成.B组实验侧术后8、12周出现少量的类软骨细胞,对照侧只有纤维组织.组织学评分:术后8周复合组为5.31±0.68,而术后12周为3.23±0.52,较其他组差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 人脱细胞羊膜负载BMSCs在体内环境下能够较好的修复关节软骨缺损.
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人脱细胞羊膜治疗下肢静脉性溃疡的初步报告
目的 初步探讨人脱细胞羊膜(human acellular amniotic membranes,HAAM)治疗下肢静脉性溃疡(venous ulcers,VU)的安全性和有效性.方法 2013年1月-4月应用HAAM治疗4例左下肢VU男性患者.患者年龄60～65岁,平均62.3岁.病程4～13个月,平均7个月.溃疡范围3.0 cm×1.0 cm～5.0 cm×2.5 cm.疼痛视觉模拟评分(VAS)为6～8分,平均6.75分.结果 治疗后3 d HAAM与溃疡创面贴附率达100％;治疗后1周均表现为促进创面愈合.2例创面完全愈合,2例经再次补充HAAM后创面面积及深度均改善.治疗期间疼痛VAS评分均逐渐降至0分.患者无局部皮肤炎症和全身过敏反应症状,随访3个月无复发.结论 HAAM治疗下肢VU操作简便,初步结果提示治疗安全且能较快有效改善创面.
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脱细胞羊膜的制备及其生物相容性研究
目的制备脱细胞人羊膜(HAAM),检测其细胞相容性和组织相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性. 方法新鲜人羊膜经漂洗后戊二醛交联,0.5%SDS震摇24小时,胰蛋白酶消化4小时,充分漂洗,冷冻干燥,分装,环氧乙烷消毒备用.倒置相差显微镜和扫描电镜观察表面结构,测量孔径,并作HE、Mallory染色.体外培养人成纤维细胞并复合于HAAM,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附、生长,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定HAAM浸提液对培养的人成纤维细胞的细胞毒性.将HAAM植入SD大鼠背部皮下,观察其组织相容性. 结果 HAAM的一面为网状结构,孔径为10～80 nm,另一面为致密纤维结构.HE、Mallory染色表明材料无细胞残留,均为胶原组成.成纤维细胞能在HAAM上黏附、增殖.MTT示材料细胞毒性为0或1级,动物埋置实验无异常反应. 结论应用去垢剂-酶消化法处理新鲜人羊膜,能有效去除组织中的细胞和可溶性成分,可进一步降低其免疫原性,保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损的修复材料及组织工程的膜支架材料.
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人脱细胞羊膜复合脂肪源性干细胞修复大鼠全层皮肤缺损的实验研究
目的 人脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane,HAAM)含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,这些成分能为细胞增殖、分化提供丰富营养.研究HAAM与脂肪源性干细胞(adipose-derived stemcells,ADSCs)的生物相容性,探讨HAAM复合ADSCs构建真皮替代物修复全层皮肤缺损的可能性. 方法 取健康4月龄SD大鼠30只,雌雄不限,体重250～300 g,于腹股沟处获取脂肪行ADSCs体外分离、培养和传代;取第3代细胞行HE染色及CD44、CD49d、CD34免疫细胞化学染色鉴定.应用物理和酶消化法处理自愿捐赠的人羊膜获得HAAM,行HE染色观察细胞是否脱除干净,扫描电镜观察HAAM结构特征.将第3代ADSCs以2×10~5个/cm~2密度接种于HAAM上皮面,体外共培养1～5 d后分别行扫描电镜和MTT检测,不加材料组设为对照组.将大鼠随机分为3组,每组10只,建立背部直径为2 cm的全层皮肤缺损模型.A组创面植入复合ADSCs的HAAM,B组植入单纯HAAM,C组常规包扎.术后行大体观察,于术后1、2、4周计算创面愈合率,并取创面皮肤行HE染色和细胞角蛋白19(cytokeratin19,CK19)免疫组织化学染色观察. 结果 HE染色示第3代ADSCs呈梭形,胞核为椭圆形,位于细胞中央;免疫细胞化学染色示第3代ADSCs表达CD44和CD49d,不表达CD34.HAAM行HE染色未见细胞残留;扫描电镜下见HAAM两面具有不同的三维结构,上皮面为较致密的网状纤维;基质面为较稀疏的胶原纤维,未见纤维发生融合、断裂和降解.ADSCs-HAAM复合培养3 d后扫描电镜下可见细胞生长状态良好,胞体肥大呈梭形隆起,胞膜外绒毛致密略有弯曲,胞体下方形成丰富的伪足牢固黏附于HAAM上;培养1～5 d,MTT检测示实验组和对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05).移植术后1、2、4周,A组创面愈合率均高于B、C组,B组高于C组,差异均有统计学意义(P<0.05).HE染色示A组创面愈合速度快于B、C组;A组CK19表达亦明显高于B、C组. 结论 HAAM复合ADSCs构建真皮替代物对大鼠全层皮肤损具有良好的促愈合作用.
