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sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达
背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。
目的：构建 sox9基因慢病毒载体以及 LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9和LMP1基因的表达情况。
方法：双酶切从 GeneArt 提供的含 sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。
结果与结论：测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 sox9基因的 Lenti-SOX9-GFP 慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带 LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。 -
EB病毒LMP1基因C端区缺失突变与肿瘤发生相关性的Meta分析
目的 探讨Epstein-Barr(EB)病毒LMP1基因C端区缺失突变与肿瘤发生的关系.方法 通过计算机检索Cochrane Library、PubMed、EMBASE、中文期刊全文数据库、维普中文科技期刊数据库、中国知网全文数据库(CNKI)等数据库中发表于1995年1月～2012年5月的与EB病毒LMP1 30 bp缺失相关的文献,根据文献纳入标准提取相关数据.采用Stata 11.0软件进行Meta分析,计数资料采用OR及95％ CI表示,对病例组、对照组LMP1基因C端区30 bp缺失进行分析.各组中研究异质性无统计学意义(P≥0.1)时采用固定效应模式分析,否则采用随机模式分析.结果 纳入针对EB病毒LMP1基因C端区缺失突变的文献共13篇.通过对纳入的文献进行Meta分析发现,LMP1 30 bp缺失与肿瘤发生相关,95％ CI为2.88(1.29 ～6.41),合并统计值Z=2.59,P=0.01.结论 EB病毒LMP1基因C端区的缺失突变与肿瘤发生存在相关性.
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LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验
目的 探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响.方法 利用脂质体介导的pGL6-LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE-1中LMP1的表达;通过MTI比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE-1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响.结果 死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE-1和CNE-1-LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4(death receptor 4,DR4),死亡受体5(death receptor,DR5)表达差异无统计学意义(P＞0.05).Westem blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE-1细胞中caspase-8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase-3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE1-LMP1细胞,而Bcl-2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式(truncated form of Bid,tBid)和caspase-9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别.JC-1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别.结论 LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗.
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含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定
目的构建一种双基因真核表达载体,使之表达人突变型p53蛋白(p53ml)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1),为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础.方法通过基因重组技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53 mt;采用脂质体lipofectAMINETM 2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中,转染后48h,采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达.结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析,结果与预期相符合;转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达.结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒1MP1的真核载体pLMP1-p53 mt,其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴.
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鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失
背景与目的:众所周知, EB病毒 LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用.本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织 EB病毒 LMP1基因 N-末端区 XhoⅠ酶切位点的丢失,探讨 LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用.方法 :收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本 63例.收集 EB病毒健康携带者外周血单个核细胞 (PBMCs) 10例作为对照.采用 QIAamp DNA Mini Kit和 QIAamp DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的 DNA,应用巢式 PCR扩增 EB病毒 LMP1基因的 N-末端区,并用 XhoⅠ对扩增产物进行酶切.采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析.结果: 10例健康携带者外周血单个核细胞的 EB病毒 LMP1基因 N-末端区均未见 XhoⅠ酶切位点的丢失.63例鼻咽癌组织中有 50例(79.37%)出现 XhoⅠ酶切位点的丢失(XhoⅠ-loss),还有 4例(6.34%)为 XhoⅠ酶切位点部分丢失,只有 9例(14.29%)未见 XhoⅠ酶切位点的丢失(wt-XhoⅠ ).除了 XhoⅠ酶切位点的丢失 (nt: 169423～169428; GAGCTC→ GATCTC)外,还发现四个错义点突变.结论:本研究所检测的广东地区 EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的 EB病毒 LMP1基因为 wt-XhoⅠ,而在鼻咽癌组织中主要为 XhoⅠ-loss.因此,我们认为 EB病毒 LMP1基因 N-末端区 XhoⅠ酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的.
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人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立
目的:建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型,为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具. 方法:通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产3 wk龄子代鼠进行PCR初选,再通过Southern杂交进一步确证;利用HE染色法观察4 mo龄转基因小鼠不同组织病理变化. 结果:将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射,然后植入30只假孕母鼠的输卵管中,其中26只母鼠怀孕,移植成功率为86.67%;共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因,转基因阳性小鼠比例为5.03%(9/179),Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠;随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症,鼻咽黏膜上皮灶性增生. 结论:成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠,且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生,可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.
