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miRNA-140靶向结合自噬相关基因ULK1的验证
背景:自噬可以通过抑制凋亡来缓解膝骨关节炎,miR-140是否可以调节自噬关键基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1(uncoordinated 51 like kinase-1,ULK1)基因未见报道.目的:探索miRNA-140对ULK1基因的调控关系.方法:通过miRNA靶基因预测网站预测ULK1基因是否为miRNA-140的靶基因;将ULK1基因的3'端非翻译区全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,通过构建结合位点的突变序列,得到野生型和突变型载体,分别用野生型和突变型海肾荧光素酶载体转染293T细胞,检测每种转染细胞海肾荧光素酶的表达活性;运用miRNA-140 inhibitor对293T细胞进行干预,Western blot检测ULK1蛋白表达水平.结果与结论:与野生型载体组细胞相比,加入miR-140 mimics后荧光素酶的表达活性明显降低(P<0.01);当抑制miRNA-140后,ULK1蛋白的表达明显升高(P<0.01).结果证实,miRNA-140可以与ULK1基因靶向结合从而调控其表达.
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miRNA-140在早期骨关节炎软骨细胞中的表达规律及功能
目的 观察早期骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞中miRNA-140的表达规律以及转染ds-miRNA-140对软骨细胞功能的影响.方法 建立兔OA模型,获得正常软骨细胞(A组)和4周(B组)、8周(C组)OA软骨细胞,应用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组miRNA-140相对表达量以及Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1)和金属蛋白酶13(MMP-13)的表达情况.各组软骨细胞转染ds-miRNA-140后,观察细胞Col2a1、MMP-13的表达情况.结果 B组、C组软骨细胞miRNA-140的表达和A组相比分别下降到63％和57％ (P＜0.01),而B组和C组软骨细胞miRNA-140的表达差异无统计学意义(P＞0.05);B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达和A组相比分别减少了52％和63％ (P＜0.01),B、C两组软骨细胞MMP-13 mRNA的表达和A组相比分别升高了3.01倍和4.15倍(P＜0.01).转染ds-miRNA-140后,B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达分别增加了60％和127％ (P＜0.01),B、C两组MMP-13 mRNA的表达在转染后是转染前的54.53％和42.61％ (P＜0.01).CoL2a1和MMP-13蛋白表达水平变化趋势与mRNA一致.结论 OA早期关节软骨miRNA-140的表达显著减少;转染ds-miRNA-140可增加软骨细胞Col2a1表达,同时降低MMP-13的表达.
关键词： 骨关节炎 miRNA-140 软骨细胞 胶原Ⅱ型 基质金属蛋白酶 13 -
miRNA-140过表达腺病毒载体的构建及鉴定
目的:构建稳定表达成熟miRNA-140腺病毒表达载体.方法:从人类基因组中扩增出带有酶切位点的miRNA-140目的基因,将目的基因连接到穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP,进一步将带有目的基因的穿梭质粒重组到骨架质粒AdEasy,并将重组质粒转染到AAV-293细胞中包装成腺病毒载体,经过二次扩增之后获得高滴度的腺病毒,并且检测其包装效率及感染滴度.后,用目的腺病毒感染骨肉瘤细胞,通过荧光定量PCR方法检测miRNA-140表达情况.结果:酶切鉴定和测序结果均表明,miRNA-140成功克隆入pDC316-mCMV-EGFP载体中.与AdEasy重组后,包装纯化具有感染性的腺病毒miRNA-140,通过荧光定量PCR检测,软骨肉瘤细胞中miRNA-140升高4.2±0.2倍.结论:成功构建了成熟miRNA-140的腺病毒表达载体.
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miRNA-140在骨性关节炎中的研究进展
骨性关节炎(OA)是伴随疼痛和关节运动障碍的一种以关节软骨退变和关节周围形成骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病.临床治疗往往不能令人满意.在 OA 治疗新进展中基因网络得到广泛研究,尤其是 MicroRNA 在OA的发病机制过程中有所表达并具有调控降解和修复等作用.该文通过 miRNA结构功能;miRNA-140在OA的发病中调控机制、作用靶点以及miRNA-140在骨生长板的作用机制结合近几年的国内外研究做一综述.
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独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA-140的影响
目的:观察独活寄生汤含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达miRNA-140的影响,探讨独活寄生汤防治骨关节炎的作用机制.方法:4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代(F3)软骨细胞进行鉴定.用10 ng?mL-1白细胞介素-1β 诱导F3软骨细胞,复制退变软骨细胞模型.成功后随机分为模型组和独活寄生汤含药血清组,分别在培养24,48,72 h后采用TaqMan real-time PCR法检测各组miRNA-140表达.结果:独活寄生汤含药血清组miRNA-140相对表达量随着干预时间的延长逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论:独活寄生汤治疗骨关节炎的部分作用机制是有效促进退变软骨细胞miRNA-140的表达.
