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丙酮酸脱羧酶及其在手性合成中的应用
主要介绍了酿酒酵母和移动单孢中丙酮酸脱羧酶的结构、性质及其在手性合成中的应用,包括反应的机理、底物范围和影响反应的因素.
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酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达
目的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的克隆和表达.方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达.结果扩增出长约1.7 kb的PDCsc基因,成功构建其表达质粒pSC-22b,对转化菌株的SDS-PAGE分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的18.6%.结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株,为实现利用PDCsc进行的生物转化奠定基础.
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移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达
目的 克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因.方法 利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达.结果 扩增出DNA碱基对数目约1.7kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM-22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%.结论 成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础.
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辛醇/水两相体系中生物合成L-苯基乙酰基甲醇的研究
利用酿酒酵母作为生物催化剂合成L-苯基乙酰基甲醇(L-Phenylacetylcarbiol,L-PAC)的过程中,通过加入有机溶剂(辛醇)形成两相体系,可改善底物和产物的溶解度,以减少对细胞内丙酮酸脱羧酶(PDC)的强烈抑制和钝化作用,从而促进L-PAC产量的提高.实验结果表明,两相体系合成L-PAC的佳条件为活化60 min,苯甲醛的起始浓度940 mmol/L,丙酮酸钠的起始浓度460 mmol/L,葡萄糖的含量8％,水醇两相体积比为3:1,且加入一定量的甘油时,L-PAC产量可达在醇相中24.1 g/L和水相中3.7 g/L,比单一水相体系高出1.8倍.
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双酶法生物合成L-苯基乙酰基甲醇的研究
双酶偶联体系越来越受到人们重视,广泛应用于医药、食品等领域,是实现高效生物合成的重要方法.本文利用乳酸氧化酶(Lactate Oxidase,LOD)和丙酮酸脱羧酶(Pyruvatedecarboxylase,PDC)偶联构建双酶体系,催化乳酸钠和苯甲醛合成L-苯基乙酰基甲醇( L-Phenylacetylcarbinol,L-PAC),后者是合成L-麻黄素的重要中间体.转化反应的佳温度为34℃,pH6.8,转化时间6h,苯甲醛用量160 mmol/L,乳酸钠用量330 mmol/L,葡萄糖用量3 g/100 mL,L-PAC产量达到8.79 g/L.在L-PAC的制备过程中,以廉价的乳酸钠代替丙酮酸大大降低了生产成本,缩短了反应时间,简化了操作步骤,有利于工业生产.双酶偶联体系为生物合成L-PAC提供了一个新的思路和新方法.
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裂殖酵母生物合成L-苯基乙酰基甲醇的研究
用裂殖酵母作为生物催化剂,催化苯甲醛与丙酮酸合成L-苯基乙酰基甲醇(L-PAC),后者为合成L麻黄素等多种药物的前体,转化反应的佳温度为28℃,pH6.0,时间16 h,苯甲醛用量160～200mmol/L,丙酮酸120～180 mmol/L,L-PAC产量可达15 g/L.
