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加味千金苇茎汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织SIGIRR蛋白及其mRNA表达的影响
目的:探讨加味千金苇茎汤对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠肺组织单免疫球蛋白IL-1相关蛋白(single immunoglobulin IL-1 related protein,SIGIRR)及其mRNA表达的影响.方法:Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组和加味千金苇茎汤组(每组8只).采用脂多糖气管滴注联合烟熏方法建立COPD大鼠模型,采用免疫组化ABC法和实时荧光定量聚合酶链反应检测SIGIRR蛋白及其mRNA表达,观察加味小青龙汤对上述指标以及肺组织病理形态学变化的影响.结果:与正常组比较,模型组肺组织SIGIRR蛋白表达明显降低(P＜0.05);与模型组比较,地塞米松组和加味千金苇茎汤组肺组织SIGIRR蛋白及其mRNA的表达明显升高(P＜0.01).病理观察显示,模型组肺内细支气管上皮空泡变性坏死脱落,管壁结构破坏,大量炎细胞浸润,腔内炎性充满渗出物,地塞米松组和加味千金苇茎汤组仅见轻度肺间质炎症.结论:加味千金苇茎汤能够减轻慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织的损伤,对COPD模型肺组织有保护作用,其机制可能与其能够上调SIGIRR蛋白表达有关.
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SIGIRR在人肺癌组织中表达的临床意义
目的 研究肺癌组织中SIGIRR蛋白的表达及其临床意义.方法 用western blot蛋白定量方法检测48例人肺癌组织中SIGIRR蛋白的表达及其与淋巴结转移、组织分化程度、临床TNM分期、性别及病理类型的关系.结果 肺癌组织中SIGIRR蛋白表达水平较正常肺组织明显增加(0.248±0.052 vs 0.125±0.005,P＜0.01),且其表达水平与淋巴结转移、组织分化程度及临床TNM分期密切相关(P＜0.05),而与患者性别和病理类型无关(P＞0.05).结论 人肺癌组织中SIGIRR蛋白表达水平增高,在人肺癌淋巴结转移、组织分化方面可能起一定的抑制作用.
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SIGIRR对CpG诱导的人气道H292细胞TLR9表达的影响
目的 研究SIGIRR对未甲基化的胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)诱导的人气道卜皮细胞株H292细胞钟形受体9(TLR9)表达的影响.方法 本实验对象包括6组,分别为H292组、空质粒转染组(eH292组)、SIGIRR转染组(sH292组),以及给予CpG刺激后的H292组(CH292组)、eH292组(CeH292组)和sH292组(CsH292组).构建SIGIRR-EGFP融合蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法转染人气道上皮细胞株H292,经CpG刺激后,Western blot检测人气道H292细胞TLR9的表达,ELISA检测人气道上皮细胞H292分泌IL-6的水平.结果 CH292组、CeH292组和CsH292组细胞较H292组、eH292组、sH292组细胞TLR9蛋白表达量增加(P均＜0.01);CsH292组细胞产生的IL-6(3.41±0.08 pg/ml)少于CH292组(4.27±0.07 pg/ml)及CeH292组(5.04±0.05 pg/ml)(P均＜0.05)、而TLR9蛋白表达量差异无统计学意义.结论 CpG可诱导H292细胞表达TLR9蛋白,SIGIRR上调表达可抑制CpG诱导的H292细胞IL-6的产生,对TLR9表达无影响.
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SIGIRR过表达抑制树突状细胞成熟并诱导同种移植免疫耐受的研究
目的 观察过表达SIGIRR基因抑制树突状细胞(DCs)成熟活化、诱导移植免疫耐受的效果.方法 体外培养扩增骨髓来源DCs,并借助带绿色荧光蛋白(GFP)荧光的腺病毒载体将SIGIRR基因转入DCs,分别应用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SIGIRR基因修饰的未成熟DCs(imDCs)在脂多糖刺激前后细胞表型及功能变化;建立小鼠同种异体胰岛移植模型,术前连续3d受体分别给予尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)、imDCs、DC-GFP及DC-SIGIRR,观察各组小鼠胰岛移植物活性及其生存时间,同时在术后第7天取移植物做苏木素-伊红(HE)及免疫荧光检查,比较各组移植物排斥反应强度.结果 过表达SIGIRR的DCs经脂多糖刺激后仍稳定在未成熟状态:低表达人类主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ、CD40、CD80、CD86,分泌低水平白细胞介素(IL)-12[(547.80±84.67)pg/ml,P=0.026]及高水平IL-10[(410.40±36.11)pg/ml,P=0.031],与其他两组差异有统计学意义.术后糖耐量试验提示比较其他对照组,SIGIRR组血糖峰值更小[(19.0±1.0)mmol/L,P=0.041],胰岛移植物生存时间显著优于其他各组[(14.3±3.6)d,P=0.036].术后免疫组织化学提示SIGIRR组胰岛移植物活性优于其他对照组.结论 SIGIRR基因有效抑制未成熟DCs在脂多糖等外源刺激因子作用下的成熟和活化,抑制抗原提呈功能,在一定程度上延长移植物存活时间,诱导移植免疫耐受形成.
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骨癌痛大鼠髓内SIGIRR的表达变化
目的 本研究针对目前日益增长的骨癌痛病患的疼痛问题进行试验探讨.建立癌痛动物模型寻找有效缓解疼痛的方法,进一步探讨骨癌痛大鼠模型中髓内细胞蛋白SIGIRR的表达水平的变化.方法 建立SD大鼠胫骨癌痛模型,随机分为空白组(10只)和骨癌痛模型组(10只).通过大鼠痛行为学测试、影像学、组织学方法对大鼠胫骨癌痛的模型进行验证.运用RT-PCR和Western blot检测髓内蛋白细胞LTR4和SIGIRR表达变化.结果 Walker256大鼠乳腺癌细胞制备大鼠胫骨癌痛的模型骨癌造模成功.模型组的体质量不增或者降低(P＜0.01)、SAPS显著增加(P＜0.01)、PWTL差异不大(P＞0.05).RT-PCR检测的TLR4结果显示,骨癌痛模型组比空白组表达明显增加.Western blot检测骨癌痛模型组比空白组髓内蛋白细胞SIGIRR明显下降.结论 骨癌痛大鼠髓内蛋白细胞SIGIRR表达的降低可能与骨癌痛的发生机制相关.
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SIGIRR对H292细胞Toll样受体4、5、9致炎作用的影响及机制研究
目的 观察SIGIRR(sigh Ig IL-IR-related molecule)对人气道上皮细胞株H292中Toll样受体(TLR)4、5、9致炎作用的影响,并初步了解其作用机制.方法 运用脂质体转染的方法,将SIGIRR-EGFP融和蛋白真核表达载体稳定转染H292细胞,通过免疫细胞化学技术观察H292细胞中SIGIRR的过表达情况;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006处理后,ELISA检测重组质粒(SIGIRR-EGFP)、空质粒(pEGFP-N1)转染以及未转染的H292细胞分泌致炎因子TNF-a和IL-6水平;通过免疫共沉淀的方法了解SIGIRR与MyD88之间的关系.结果 激光共聚焦显微镜显示重组融合蛋白SIGIRR-EGFP与H292内源SIGIRR共定位于细胞膜上;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006刺激后,重组质粒转染的H292细胞分泌的IL-6和TNF-a水平显著低于空质粒转染和未转染的H292细胞(P＜0.01);免疫共沉淀提示H292细胞受到刺激后,SIGIRR与MyD88有较强相互作用,可与TLR4、5、9竞争结合MyD88分子.结论 SIGIRR对H292细胞TLR4、5、9致炎通路的负性调节作用,可能是通过减少MyD88分子与TLR4、5、9的结合,从而削弱了炎症信号的细胞内转导.
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SIGIRR-EGFP真核表达载体构建及在H292细胞中的亚细胞定位研究
目的 通过增强型绿色荧光蛋向示踪技术,观察SIGIRR(single Ig IL,1R-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的分布特点及对上皮细胞天然免疫功能的影响.方法 构建SIGIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法转染人气道上皮细胞株H292,再利用激光共聚焦显微镜对其进行亚细胞定位研究.经LPS刺激后,ELISA检测转染前 后上皮细胞TNF-α分泌水平的差异.结果 构建的融和蛋白表达载体SIGIRR-EGFP经EooR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,电泳显 示其条带大小为4.7 kh和1.23 kb左右,经测序证实SIGIRR的序列与GenBank公布的人cDNA序列完全一致.激光共聚焦显示pEGFP-N1空载体转染表达的绿色荧光蛋白在H292细胞中均匀分布,而重组载体SIGIRR-ECFP表达的融和蛋白在H292细胞核周(膜)和细胞膜边缘上有连续分布现象.经LPS刺激后,pEGFP-N1转染的细胞和未转染细胞TNF-α水平无显著性差异(P＞0.05),而SIGIRR-EGFP转染细胞与pEGFP-N1转染细胞相比,显著降低了TNF-α的产生(P＜0.01).结论 成功构建了SI-GIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,并利用绿色荧光蛋白标记的方法显示了SIGIRR分子在H292细胞中细胞膜分布.过表达的SIGIRR降低了上皮细胞IPS诱导的炎症因子TNF-α产生.
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SIGIRR与TLRs信号通路
Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是固有免疫系统中的主要病原模式受体之一,TLRs通路的激活在全身性炎症反应和天然防御免疫中起着重要作用[1].但是过度的TLR应答会引发抗炎与致炎间的失衡导致机体损伤.SIGIRR(single Ig IL-1-related receptor)--单Ig区IL-1相关受体,又称Toll-IL-1R8(TIR8),是新近发现的TLR/IL-1R超家族成员之一[2].近年研究表明,SIGIRR对TLRs信号通路有负性调控作用.
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SIGIRR对LPS诱导的H292细胞TLR4表达的影响
目的 通过上调SIGIRR(single Ig IL-IR-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的表达,研究SI-GIRR对LPS诱导的H292细胞TLR4表达的影响.方法 构建SIGIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法 转染人气道上皮细胞株H292,经LPS刺激后,ELISA检测转染前后上皮细胞TNF-a分泌水平的差异,Western blot(WB)检测TLR4表达的变化.结果 构建的融和蛋白表达裁体SIGIRR-EGFP经EcoRI和BamHI双酶切后,电泳显示其条带大小为4.7kb和1.23kb左右,经测序证实SIGIRR的序列与GenBank公布的人cDNA序列完全一致.SIGIRR-EGFP转染细胞与pEGFP-N1转染细胞和对照组细胞相比,TNF-a产生明显下降,而TLR4表达无明显变化.结论 SIGIRR上调表达可抑制LPS诱导的H292细胞TNF-a的产生,对TLR4表达无影响,提示SIGIRR在该信号通路中起"刹车"作用可能是通过抑制其下游通路中某个或某些调节蛋白的表迭完成的.
