首页 > 文献资料
-
骨髓间充质干细胞免疫调节机制的实验研究
目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)上的吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)活性对异基因T淋巴细胞增殖的影响,进而探讨MSCs的免疫调节机制.方法:从人骨髓中分离培养MSCs,并通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度.经200 U/ml IFN-γ作用后的MSCs以RT-PCR和Western blot分别检测IDO mRNA和IDO蛋白表达.有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下,分别以1×105、5×104、1×104、5×103个MSCs与5×105个外周血异基因T淋巴细胞(MSCs: T数量比为1: 5、1: 10、1: 50、1: 100)建立混合淋巴细胞培养体系(MLR),以单独培养T淋巴细胞为对照组,MTT法检测T淋巴细胞增殖率,反相高效液相色谱法检测各MLR体系上清中IDO活性.结果:IFN-γ作用后的MSCs出现IDO mRNA和IDO蛋白的表达.当MSCs为1×105、5×104、1×104(即MSCs: T为1: 5、1: 10、1: 50)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显著降低,IDO活性显著升高;加入1-MT后,T淋巴细胞的增殖率及IDO活性均恢复.当MSCs为5×103(即MSCs: T为1: 100)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率轻度升高(P＞0.05),IDO活性无明显变化(P＞0.05).结论:MSCs通过IDO活性在体外发挥免疫抑制作用.
-
重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定
目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体.方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段.将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞.对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析.重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;采用Wester blot检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度.结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml.结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础.
-
脐带血间充质干细胞的分离培养及诱导表达IDO对免疫介导再生障碍性贫血小鼠的治疗研究
目的:从人脐带血中分离和培养脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB MSCs),探讨其吲哚胺2,3-过氧化酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)活性对MSCs治疗再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)的影响.方法:采集足月分娩儿脐带血,淋巴细胞分离法分离培养UCB MSCs.倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达,成骨与成脂诱导鉴定UCB MSCs分化潜能.建立免疫介导AA小鼠模型,尾静脉输注经γ-干扰素(IFN-γ)诱导的UCB MSCs,观察对AA小鼠的治疗效果.结果:UCB MSCs培养1周可见少量贴壁梭形细胞,于3周左右细胞生长形态较均匀,成纤维样、平行排列或漩涡状;传代细胞1周即可见80%左右融合.流式检测细胞表面标志物,不表达造血标志物CD34,CD44、CD73阳性表达率分别为94.36%和92.48%.UCB MSCs经IFN-γ诱导表达IDO活性,对AA小鼠造血恢复具有治疗作用.结论:脐血分离培养的MSCs在IFN-γ诱导作用下,其IDO基因表达对于免疫介导AA小鼠模型具有治疗作用.
-
内皮源性吲哚胺2,3过氧化酶对自体移植静脉桥狭窄的抑制作用
目的:观察内皮源性吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)对自体移植静脉桥狭窄的抑制作用.方法:成年长耳大白兔32只,随机分为实验组和对照组,每组16只.实验组利用建立内皮细胞高表达IDO的颈静脉作为血管桥,对照组则利用质粒载体建立静脉桥.分离并切取2cm长颈外静脉,移植到自体同侧颈总动脉中.分别于术后当天、第7 天、第14 天和第21 天取两组动物各4 只,完整取下移植静脉桥,常规石蜡包埋,切片后分别行HE染色及PCNA免疫组化染色,计算静脉桥中膜厚度和平滑肌细胞PCNA阳性指数.结果:两组移植静脉桥中膜均有不同程度增厚,且有随移植时间延长而增加的趋势.移植后第21天实验组静脉桥中膜厚度测值明显小于对照组(P<0.05),且平滑肌细胞PCNA阳性指数明显低于对照组(P<0.05).结论:内皮源性IDO对移植静脉内平滑肌细胞增生有抑制作用.
-
γ干扰素体外诱导骨髓间充质干细胞的IDO表达及其免疫调节作用
目的 探讨γ干扰素(IFN-γ)体外诱导作用成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)的表达及IDO对异基因T淋巴细胞增殖的影响.方法 从人骨髓中分离、培养MSCs,观察传代3次以上的细胞形态,应用流式细胞术检测其表面标志,以鉴定其纯度.分别用浓度为0、20、50、100、200 U/ml的IFN-γ诱导作用MSCs后,以逆转录聚合酶链反应检测IDO mRNA的表达,蛋白印迹法检测IDO蛋白的表达,反相高效液相色谱法检测色氨酸的特异代谢产物犬尿氨酸的特异代谢率,以此判断IDO的活性.以丝裂霉素C灭活的外周血单个核细胞为刺激细胞,异基因T淋巴细胞为反应细胞,与经200 U/ml IFN-γ作用的MSCs组成混合淋巴细胞培养体系,MSCs与反应细胞的比例分别为1:5、1:10、1:50及1:100,部分混合淋巴细胞培养体系中加入IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT),检测T淋巴细胞增殖率及培养体系中IDO活性.结果 MSCs培养传代3代以后的纯度达到95%.在无IFN-γ作用时,MSCs没有IDOmRNA表达,经不同浓度的IFN-γ诱导后,均可检测到IDO mRNA表达,且表达强度呈IFN-γ剂量依赖性;IDO蛋白的表达与IDOmRNA一致;随着IFN-γ浓度的增加,MSCs培养上清液中的色氨酸浓度降低,而犬尿氨酸浓度升高.在无MSCs的混合淋巴细胞培养体系中,T淋巴细胞的增殖率为(80.2±5.7)%,当MSCs与反应细胞之比为1:5、1:10、1:50及1:100时,T淋巴细胞的增殖率分别为(28.1±3.2)%、(38.6±4.0)%、(57.2±2.5)%和(84.1±4.6)%,若在相同的混合淋巴细胞培养体系中加入1-MT,则MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用基本消失;培养体系中IDO的活性与MSCs的数量成正比.结论 γ干扰素在体外能诱导MSCs的IDO表达,其表达水平与γ干扰素呈剂量依赖性;IDO能抑制T淋巴细胞增殖.
-
IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究
目的 构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础.方法 将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度.用重组慢病毒以佳MOI值感染hUCMSCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR 及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况.结果 经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108TU/mL.通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上.RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA 表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性.结论 成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达.
-
脐血间充质干细胞表达的IDO对异基因淋巴细胞的增殖及再生障碍性贫血小鼠造血恢复的影响
目的 探讨脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)发挥免疫调节作用机制及对再生障碍性贫血小鼠的治疗效应.方法 采集足月胎儿脐带血,采用羟乙基淀粉沉降+淋巴细胞分离两步法分离培养UCB-MSCs.观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨、成脂诱导鉴定分化潜能.研究UCB-MSCs表达吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)的情况.建立UCB-MSCs与异基因淋巴细胞共培养体系,探讨其发挥免疫调节作用的机制;同时构建免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型,观察其对再障造血恢复的影响.结果 UCB-MSCs为成纤维样细胞,贴壁生长.流式细胞仪检测结果 表明,其不表达造血标志CD34,高表达CD44、CD73,体外成功诱导成骨与成脂分化.经γ干扰素(IFN-γ)诱导表达IDO活性,对异基因淋巴细胞的增殖可能发挥免疫抑制作用.MSCs输注再生障碍性贫血小鼠模型,可减轻小鼠骨髓造血衰竭程度.结论 UCB-MSCs在体外成功分离培养,并具有间充质干细胞生物学特性;MSCs可能通过IDO途径发挥免疫负调控作用.UCB-MSCs的IDO表达对于免疫介导再障小鼠模型的骨髓造血恢复具有改善作用.
