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GAD65真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建GAD65真核表达载体,并分析其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达.方法 从SD大鼠脑中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增GAD65基因,测序鉴定后将GAD65基因克隆入pCDNA3.1中,构建真核表达载体pCDNA3.1-GAD65；原代培养大鼠间充质干细胞,以脂质体介导法将构建好的重组真核表达载体pCD-NA3.1-GAD65转染至间充质干细胞；RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测GAD65在间充质干细胞中的表达.结果 扩增的大鼠GAD65基因序列与GenBbank的参考序列完全一致,无碱基突变,双酶切证明GAD65基因已经正确克隆到真核表达载体pCDNA3.1中；转染骨髓间充质干细胞48h后,RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot证实GAD65的mRNA和蛋白能在细胞中正确表达.结论 pCDNA3.1-GAD65真核表达载体构建成功,并能在大鼠间充质干细胞中正确表达,这为下一步研究携带GAD65的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了实验基础.
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大鼠GAD65基因慢病毒载体的构建及其在MSCs中的表达
目的 构建谷氨酸脱羧酶65 (glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)重组慢病毒表达载体,感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定.方法 PCR法扩增GAD65基因,构建LV5-GFP-GAD65慢病毒载体;与包装质粒共转染293T细胞包装病毒;将慢病毒感染大鼠MSCs,荧光显微镜鉴定转染率,Western blot检测GAD65的表达.结果 双酶切及测序结果表明LV5-GFP-GAD65慢病毒载体构建成功;包装病毒产生的病毒液滴度为5×107 TU/ml;慢病毒感染大鼠MSCs的转染率高于90％,Western blot结果显示GAD65蛋白表达比对照组明显升高.结论 GAD65重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染大鼠MSCs能稳定过表达GAD65蛋白,为进一步探索侧脑室注射基因化的MSCs治疗癫痫奠定实验基础.
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携带GAD65的永生化神经前体细胞移植治疗癫痫大鼠
目的 将构建好的携带GAD65的永生化神经前体细胞(INPCs-GAD65)移植到癫痫大鼠的脑内,观察这些细胞在癫痫大鼠脑内的存活及对癫痫大鼠的治疗作用.方法 INPCs-GAD65用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记后,MRI扫描追踪观察细胞的存活状况;观察对照组、实验组大鼠在行为学、脑电图的改变;免疫组织化学观察其分化.结果 行1.5T MRI检查,见移植处在T2WI呈低信号改变,移植后7周仍可见移植处的低信号改变,随时间延长信号变浅;与对照组比较,行为学观察发现自发痫性发作次数减少差异有统计学意义;脑电图改善,痫波发放减少;移植INPCs-GAD65可分化为神经元和胶质细胞.结论 在癫痫大鼠脑内移植合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞能在脑内存活及分化,并能改善痫性发作.
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GAD65基因修饰的间充质干细胞在癫痫大鼠脑内的表达及作用
目的 观察GAD65基因修饰的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在癫痫大鼠脑内的表达及对癫痫发作的影响.方法 原代培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定第3代细胞纯度;用LV5 GFP-GAD65病毒液转染MSCs,并鉴定蛋白表达;将GAD65基因修饰的MSCs移植至戊四氮癫痫大鼠模型侧脑室后,观察其对癫痫大鼠行为学、脑电图的影响;Western blot检测细胞移植后大鼠海马组织内GAD65的表达.结果 流式细胞仪检测第3代MSCs可以达到较高纯度;LV5-GFP-GAD65转染细胞后,MSCs中能够正确过表达GAD65;细胞移植后GAD65-MSCs组大鼠癫痫的发作次数减少,发作级别减低;脑电图结果表明癫痫发作痫波减少;Western blot检测结果显示GAD65-MSCs组大鼠海马组织中GAD65含量增高.结论 脑内移植GAD65基因修饰的MSCs能明显抑制大鼠的癫痫发作.
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两种分泌型人谷氨酸脱羧酶65片段DNA疫苗的构建与鉴定
目的:构建和鉴定分泌型人谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65片段DNA疫苗.方法:从人GAD65质粒中扩增出GAD190-315和GAD490-570两个片段的cDNA,分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的片段克隆入pBudCE4.1真核表达载体,测序鉴定,并用Western印迹检测融合基因的表达.结果:核酸序列测定表明克隆的融合基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western印迹检测显示这两种人GAD65片段分泌表达.结论:两种分泌型人GAD65片段DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防提供了实验基础.
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糖尿病酮症或酮症酸中毒患者血清中ICA512及GAD抗体的检测
为了解抗ICA512及GAD65自身抗体在汉人中拟诊断为1型糖尿病的患者血清中的表达情况,选择15例糖尿病酮症或酮症酸中毒的患者及19例健康者进行血清自身抗体分析, 发现患者组抗体的阳性率明显高于正常对照组;病程<1年的患者,抗体阳性率明显高于病程>1年者.提示这些自身抗体的检测有利于糖尿病的分型,糖尿病病程长短影响抗体的检出率.
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海人酸颞叶癫痫大鼠海马GAD65表达的动态变化
目的探讨GAD65在颞叶癫痫大鼠海马的表达变化及其意义.方法112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水.选取腹腔注射后3 h、6h、12 h、24h、48 h、7d和30d为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位.腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记.用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65 mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65蛋白的表达.结果实验组大鼠海马GAD65 mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48 h～30d,GAD65mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48h,P＜0.05;7～30d,P＜0.01).结论颞叶癫痫慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的一种内源性抗痫机制.
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大鼠GAD65基因的克隆与原核表达
目的构建pGEX-6P-3/GAD65原核表达载体,获得大量纯化的大鼠GAD65蛋白.方法通过RT-PCR技术从大鼠脑组织中扩增GAD65 cDNA,克隆至PGEM-Teasy载体上并测序,利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将GAD65基因插入PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,限制性内切酶消化鉴定.IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定,并用Sepharose4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行酶切.结果扩增的GAD65长度为1758bp,测序结果与已知序列吻合.重组子经酶切鉴定,获得PGEX-6P-3 GAD65原核表达菌株,获得分子量约91 000的PGEX-6P-3/GAD65融合蛋白,分离纯化出约65 000的GAD65蛋白,Western-blot表明重组蛋白能被GAD65单克隆抗体特异结合.结论成功获得GAD65蛋白,为研究GAD65生物学作用奠定了基础.
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视网膜变性对RCS-P+大鼠γ-氨基丁酸及其合成酶谷氨酸脱羧酶65表达的影响
目的 观察视网膜变性过程中γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)及合成酶谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)的表达变化.方法 选择出生后15、30、60、90 d的RCS-P+和同年龄的RCS-rdy+-P+大鼠,采用免疫荧光(IF)和免疫印迹法(Western blot)观察两种大鼠出生后15、30、60、90 d GABA和GAD65的表达差异.结果 视网膜中GABA和GAD65主要表达于内核层、内从状层和节细胞层.随着天龄的增加,RCS-rdy+-P+大鼠中GABA阳性细胞逐渐减少.RCS-P+变性鼠在出生后15 ～60 d GABA阳性细胞随天龄增加逐渐减少,在出生后60 ～ 90 d(即视网膜变性中晚期)GABA阳性细胞大量增加,GABA表达明显高于RCS-rdy+-P+大鼠(P＜0.05).不同年龄RCS-rdy+-P+大鼠其GAD65表达恒定,发育对GAD65表达无明显影响；与同年龄RCS-rdy+-P+大鼠相比,30 d RCS-P+大鼠GAD65表达略有增加(P＜0.05),90d时大量增加(P＜0.01),其表达随病变发展明显升高.结论 在视网膜色素变性过程中,GABA、GAD65在视网膜内层的表达均有显著的升高,提示输入剥夺后GABA能无长突细胞未见损伤,其活性甚至略有增高.
