首页 > 文献资料
-
曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 原核表达曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子(IL-4-inducing principle of schistosoma eggs,IPSE),并制备小鼠多克隆抗体.方法 人工合成IPSE基因,采用PCR技术克隆其成熟体开放阅读框,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-IPSE.转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后,应用组氨酸标签蛋白纯化柱纯化包涵体蛋白,免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体.结果 克隆的IPSE基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100％;重组表达质粒pET-28a-IPSE经PCR及双酶切鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为16 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30％,可与鼠抗His单抗特异性结合；用纯化的包涵体蛋白免疫BALB/c小鼠后,获得的特异性抗血清效价为2× 10-4,该血清可与IPSE蛋白发生特异性反应.结论 已原核表达、纯化了曼氏血吸虫IPSE蛋白,并制备了高滴度的特异鼠抗血清,为进一步从日本血吸虫中筛选相似蛋白及研究其功能奠定了基础.
-
日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析
目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测.方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotictranslation initiation factor 2 alphasubunit,eIF2α基因高度同源.根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段.将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列.用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较.同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索.结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列.结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源.
