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人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的真核表达、纯化及活性鉴定
目的 利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性.方法 采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,以甲醇诱导表达,并进行Western blot检测及金属螯合层析纯化.采用MTT法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果 重组表达质粒pPIC9K-Vasostatin(120～180aa)经菌落PCR、酶切和测序鉴定,证明构建正确.经Western blot检测可见一条特异条带,纯化后的蛋白纯度达88.76%,浓度为300 μg/ml,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖.结论 人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)可在毕赤酵母中以分泌形式表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性.
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诱生型一氧化氮合酶FAD结合区的克隆、表达和活性鉴定
诱生型的一氧化氮合酶(iNOS)的表达可以被多种细胞因子、IPS、多种试剂及创伤等诱导,很多疾病的产生发展都与iNOS的过度表达有关.为进一步研究iNOS FAD结合区的功能和特异性抑制肽的筛选,用PCR方法克隆出iNOS FAD结合区编码基因片段(iNOS2031-2660bp),并在大肠杆菌中得到高效表达,得到表达率＞30%的包涵体;经过Ni金属螯合亲和柱层析和电泳纯化,得到纯度＞95%的重组蛋白,相对分子质量为23 000.运用波长扫描,证实纯化蛋白具有与FAD的结合活性,它可以作为筛选iNOS特异性抑制肽的靶蛋白.
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结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽的筛选
目的筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽.方法PCR扩增EphB2的配体结合区,定向克隆到融合表达质粒载体pRSET A中,阳性克隆经IPTG诱导表达融合蛋白,并利用Ni-NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化,以此纯化蛋白为靶,将其包被于ELISA板上,进行3轮亲和筛选.结果电泳分析表明:表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化蛋白质的纯度大于95%.从噬菌体随机12肽库中筛选到1 3个噬菌体阳性克隆.结论获得了具有结合EphB2活性的阳性噬菌体克隆且有共同的基序.
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金属螯合亲和层析法纯化人源抗TNF-α重链可变区蛋白
近年采用基因工程技术进行抗体基因的筛选、改造，获得了大量有用的抗体基因，但如何使之适当地表达和分泌，并获得有效的纯化已成为一个急待解决的问题。就目前研究的进展来看，抗体的表达和分泌不只局限于淋巴细胞和骨髓瘤细胞，在酵母、哺乳动物的非淋巴细胞和大肠杆菌乃至植物细胞中，都能获得抗体的功能性表达、分泌和组装[1-5]。大肠杆菌具有经济、简便和容易操作等特点，将其表达的抗体片段进行有效地纯化，是得到有实用价值制品的重要环节。本文使用表达质粒pQE30，对已获得的人源抗TNFα抗体基因片段进行了高效表达，并用Ni-NTA金属螯合法对表达的抗体片段进行了纯化。
