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巯基化壳聚糖季铵盐用于基因输送的研究
目的:本研究诣在对壳聚糖进行修饰,以解决其水溶性问题和基因释放困难的问题.方法:本研究通过2,3-环氧丙基三甲基氯化铵和N-乙酰-L-半胱氨酸对壳聚糖进行修饰,得到巯基化壳聚糖季铵盐(TMC-SH),使其在生理条件下带正电并含有一定量的游离巯基.以TMC-SH为基因载体,形成基因复合物.通过琼脂糖凝胶电泳考察其稳定性,并测定其粒径和ζ-电位.通过DTT条件下的粒径测定,考察基因复合物的还原响应性.结果:核磁结果表明合成TMC-SH的季铵盐取代度为22％,游离巯基-SH含量为79.22 μmol/g;琼脂糖凝胶电泳结果表明以TMC-SH为载体形成的二硫键交联的基因复合物TMC-SS/pDNA具有较好的稳定性;而且,二硫键交联以后基因复合物粒径较小,结构更为密实;在还原条件下粒径变大,表明二硫键交联的基因复合物变得疏松,说明其粒径具有还原响应性.结论:对壳聚糖进行低取代度的季铵盐修饰和一定量的巯基化修饰后,其具有较好的包载pDNA能力和还原响应性的基因释放能力.
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EGFR小分子多肽配体修饰提高阳离子脂质体对肿瘤细胞的转染效率
目的:用针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的小分子多肽配体D4修饰PEG化的阳离子脂质体,观察其提高质粒DNA和siRNA对肿瘤细胞转染效率的作用.方法:将D4连接在DSPE-PEG2000的末端以修饰PEG化的阳离子脂质体,检测该载体系统对高表达EGFR的人非小细胞肺癌细胞株H1299中质粒DNA转染效率的影响,Sirius照度仪检测质粒DNA转染后H1299细胞荧光素酶的表达,荧光显微镜观察转染FAM-siRNA后H1299细胞的荧光强度.结果:制备的脂质体／质粒DNA复合物随着电荷比的提高,复合物粒径逐渐减小,复合物Zeta电位逐渐升高.在质粒DNA的转染中,与无修饰的非靶向脂质体相比,D4修饰的脂质体可以显著提高H1299细胞中荧光素酶的表达(P＜0.05或P＜0.01)；D4修饰的脂质体在各个电荷比处对H1299细胞的转染效率显著高于无修饰的非靶向脂质体(P＜0.05或P＜0.01).在FAM-siRNA的转染中,荧光显微镜下可以观察到D4修饰的脂质体组有更高水平的FAM荧光强度.结论:D4修饰的阳离子脂质体提高高表达EGFR肿瘤细胞中质粒DNA和siRNA的转染效率.
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纳米树突状多聚物颗粒在基因治疗中的应用
基因治疗作为一种新型的治疗方法,其首要的技术问题就是实现外源基因的输送.在基因输送的研究领域中人们一直在探寻一种安全、高效的基因运输载体.许多种合成的载体被研究作为可能的基因传输工具.这些合成的载体包括带正电的多肽,阳离子脂质体和阳离子多聚物等,与病毒载体相比,这些载体具有制备方法简单,免疫原性较低,安全低毒等优点.但它们的基因转染效率都低于重组病毒载体,如腺病毒.
关键词： PAMAM dendrimer 基因治疗 基因输送 -
光化学内化作用及其在基因输送中的应用
基因药物的细胞内高效输送是基因治疗走向临床转化的关键环节.基因等生物大分子药物往往借助载体以内吞的方式进入细胞,入胞后若不能及时从内涵体/溶酶体中逃逸则极易被降解失活.光化学内化作用(photochemical internalization,PCI)作为一种新兴的光促药物输送技术,利用光照下光敏剂分子产生活性氧破坏生物膜,促进内涵体/溶酶体膜逃逸,从而避免溶酶体中酶对药物的破坏,将生物大分子等药物有效递送到细胞质中.近年来,该技术在基因等大分子药物的细胞内有效可控输送方面取得了一定成效,为基因治疗从实验室向临床应用的转化提供了可能.该文综述了PCI的作用机制及其在基因输送中的应用概况和研究进展.
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基因治疗进展与展望—磁性转染
基因输送是基因治疗中非常关键的技术,作为运载工具,非病毒载体可避免病毒载体的安全性等问题.近年来非病毒基因载体的开发颇受关注,许多新的物理化学技术应运而生,磁性纳米颗粒介导的基因转染即磁性转染(magnetofection)是其中极具运用前景的技术之一.
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通过局部转基因组织工程的研究现状
基因激活基质技术(gene activated matrix,GAM)可以在各种组织和器官的伤口部位进行局部基因输送.近年研究表明带有基因信息的质粒可以被输送到严重受伤的腱、韧带、骨、肌肉、皮肤和神经组织.而且,直接向体内的骨、皮肤和神经组织转移带有基因信息治疗的治疗型质粒能引起强烈的组织再生性反应.本文还回顾了可增强GAM技术的新技术以及可能存在的危险.
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纳米药物载体在医药领域中的研究进展
纳米本身是个长度单位,1nm等于10-9m,纳米颗粒的粒径比毛细血管通路还要小1～2个数量级.当一种物质被不断切割至一定程度,其粒子小至纳米量级即为纳米材料.纳米材料往往会产生一些新的理化特性,正是这些特有的特性,使其在药物和基因输送方面有许多优越性:①许多半衰期短的药物可能需要每天重复给药多次,制备成缓释药物后,将极大延长药物作用时间②能解决口服易水解药物的给药途径问题,大大降低药物与胃蛋白酶等消化酶接触的机会③可进行靶向给药:纳米载体经特殊加工后可达到靶向输送的目的,更加准确地对准组织或器官,减少药物对人体的不良反应④载药纳米粒可以改变膜转运机制,增加药物对生物膜的透过性,有利于药物透皮吸收与细胞内药物发挥⑤可在保证药物作用的前提下,减少给药剂量,减少药物的副作用⑥可消除特殊生物屏障对药物作用的阻碍⑦能携带多种化学药物⑧载体及其生物学降解产物易被消除.
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HBV DNA疫苗阳离子脂质体复合物转染小鼠实验研究
目的:评价阳离子脂质体作为基因输送载体的效果及初步探讨其作用机理.方法:将二油酰基磷脂酰乙醇胺(D0PE)与1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)用超声法或挤压法制成阳离子脂质体多片层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SLV).MLV或SLV与DNA(pS2.S/pFP,1:1)直接混合形成正负电荷比为3:1或1:3的阳离子脂质体/DNA复合物MLV-DNA或SLV-DNA.25只BALB/c平均小鼠分成五组:A,B,C,D,E.分别用4种阳离子脂质体/DNA复合物(A,B,D,E组)和10μg裸DNA(C组)一次性肌肉注射免疫接种小鼠.裸DNA、MLV-DNA(3:1)和SLV-DNA(3:1)分别与DNase I反应30 min后,1%琼脂糖凝胶¨0V电泳2 h分离鉴定DNA.结果:免疫接种后第2周,A组和B组血清转阳率均为40%;免疫接种后第4周,A组和B组血清转阳率均达到100%,并保持至第8周以后.免疫接种后第4周,A组血清平均抗-HBs滴度比对照的C组血清平均抗-HBs滴度高27倍(2.3706,0.9370,P＜0.02).免疫接种8周后,A组和B组小鼠血清抗-HBs水平仍呈上升趋势,平均抗体滴度分别是2.5687,1.9533.D组与E组小鼠血清未见转阳.与DNase温育30 min后,裸DNA(C组)被完全降解,而MLV-DNA(3:1)和SLV-DNA(3:1)中DNA基本保持完整.结论:阳离子脂质体是一种高效的非病毒基因输送介质;免疫接种后抗体持续高水平,可能是阳离子脂质体/DNA复合物可保护DNA免受体液中脱氧核糖核酸酶的破坏,缓慢释放DNA有关.
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DNA的核定位机制
在现代生物技术中,将外源基因转导进入细胞核是一个很重要的环节.外源基因进入细胞核进行有效的表达需要克服3个方面的问题.首先,必须保证外源基因在细胞内不受破坏,不被胞内酶所降解;其次,外源基因要能够穿过细胞膜,细胞膜是外源基因输送的一个主要屏障;第三,外源基因要有适当的机制能够通过核膜,这是外源基因输送的第二道屏障.
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超声波介导的基因输送技术
近年来超声波介导的基因输送技术由于其相对安全性和操作上的简单得到关注.本文对超声波导致的声致穿孔的机制,空化核的作用--增强基因输送的效率,以及细胞和在体基因输送效率作了综述,讨论了超声波介导的基因输送效率的影响因素.此方法充满希望并且载药的空泡可以作为一种新型药物载体在超声作用下实现药物的靶向输送.
